眼科抗菌药物加替沙星和利福平对人角膜上皮细胞的凋亡诱导作用研究
人的角膜位于眼球的最前端，而角膜上皮层又位于角膜的最外侧，是抵御外界病原体入侵的第一道防线，极易受到感染，引发角膜炎症，影响患者视力的准确性。加替沙星和利福平是目前眼科中治疗角膜炎症常用的抗生素类抗菌药物，随着应用的普及，加替沙星和利福平是否具有细胞毒性作用等问题引起越来越多的关注和重视，越来越多的研究建议降低使用浓度和剂量。但目前仍未见有关于加替沙星和利福平对人角膜上皮(HCEP)细胞毒性作用的详细报道，本实验以实验室自建的非转染、无致瘤性的HCEP细胞系为研究体系，研究了加替沙星和利福平对HCEP细胞的凋亡诱导作用。 为了验证加替沙星对HCEP细胞的凋亡诱导作用，本文将临床浓度的加替沙星溶液(3 g/L)倍比稀释至0.1875 g/L，对体外培养的HCEP细胞加药处理后发现浓度高于0.75 g/L的加替沙星会导致HCEP细胞形态发生明显变化，细胞发生皱缩变圆，甚至脱壁死亡。这说明0.75～3 g/L浓度的加替沙星对HCEP细胞有比较明显的毒性作用，且具有时间和浓度依赖性。为了探究加替沙星对HCEP细胞的毒性作用机理，本文用0.1875～3 g/L梯度稀释的加替沙星处理HCEP细胞，然后进行吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光双染色实验，结果发现浓度高于0.75 g/L时加替沙星能显著提高HCEP细胞质膜的通透性，且加替沙星对HCEP细胞的毒性作用有明显的浓度和时间依赖性，提示这种毒性作用可能是凋亡诱导作用。通过对加替沙星处理后的HCEP细胞基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳后发现，1.5 g/L的加替沙星处理HCEP细胞28h和32h均出现了典型、清晰的梯状条带，细胞核DNA发生大规模片段化。透射电镜观察结果显示细胞结构出现紊乱，细胞质中出现空泡化，染色质出现固缩并边缘化，并有凋亡小体的形成等典型的细胞凋亡特征,表明加替沙星对 HCEP细胞的毒性作用是凋亡诱导作用。进行Annexin-VFITC检验发现，1.5 g/L加替沙星处理4h后的HCEP细胞即进入早期凋亡状态，24h后大部分细胞进入晚期凋亡状态。通过检测加替沙星处理后的HCEP细胞的线粒体膜电位，发现HCEP细胞线粒体膜电位会被去极化，揭示HCEP细胞在加替沙星的诱导下可能通过线粒体途径发生凋亡。 为验证利福平对 HCEP细胞的凋亡诱导作用，本文将临床浓度的利福平溶液(0.5 g/L)倍比稀释到31.25 mg/L，对体外培养的HCEP细胞进行处理后，观察发现利福平浓度高于0.125 g/L时，HCEP细胞皱缩，出现明显的空泡化，甚至脱壁等现象,表明浓度高于0.125 g/L的利福平溶液对HCEP细胞有显著的毒性作用，且有明显的时间和浓度依赖性。为了进一步研究利福平对HCEP细胞毒性作用的机理，本文对利福平处理过的HCEP细胞进行AO/EB荧光双染色实验发现HCEP细胞的质膜通透性显著提高，提示利福平对HCEP细胞的毒性作用可能是凋亡诱导作用。通过DNA琼脂糖凝胶电泳发现，经过0.5 g/L的利福平处理32 h后的HCEP细胞基因组DNA出现了清晰典型的梯状条带，细胞核DNA发生大规模片段化。电镜下HCEP细胞呈现出结构紊乱、空泡化、染色质边缘化等凋亡特征，揭示利福平对HCEP细胞的毒性作用是凋亡诱导作用。流式细胞仪的检测结果表明，1.5 g/L的利福平处理6h后的HCEP细胞即进入早期凋亡状态，24h后大部分HCEP细胞进入了晚期凋亡状态。而线粒体膜电位的检测结果表明，HCEP细胞在利福平诱导下线粒体膜电位被去极化，其凋亡与线粒体相关。 本文以自主建立的非转染、无致瘤性的HCEP细胞系为研究体系，进行了眼科抗菌药物加替沙星和利福平对HCEP细胞毒性作用的研究，证明了临床浓度4倍稀释后的加替沙星和利福平能诱导HCEP细胞发生凋亡，具明显毒性效应，建议在临床中谨慎使用加替沙星和利福平，避免因药物的重复使用对角膜造成危害。本研究结果可作为指导眼科抗菌药物临床应用的依据。
角膜上皮细胞;眼科抗菌药物;加替沙星;利福平;凋亡诱导作用
中国海洋大学
硕士
生物工程
樊廷俊
2013
中文
R772.21;R988.1
63
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）