红树林来源Streptomyces sp.OUC6819中Drimentines类化合物生物合成研究
Streptomyces sp. OUC6819分离自我国南海红树林底泥之中，前期研究结果表明该菌株能够产生Drimentines类化合物。该类化合物具有terpenoid-DKP的杂合结构，并有广泛而显著的抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、杀昆虫和杀寄生虫等生物活性，Drimentines的独特结构与显著活性引起了科学家的关注。本论文以南海红树林链霉菌Streptomyces sp. OUC6819为研究对象，对其中Drimentines类化合物的生物合成进行了初步研究，取得了以下研究结果： 1.以SuperCos1为载体，构建了Streptomyces sp. OUC6819的基因组文库。提取Streptomyces sp. OUC6819基因组DNA，并用Sau3AⅠ进行部分酶切后，脱磷，回收30-50kb基因组片段，与经XbaⅠ酶切脱磷后并用BamHⅠ酶切处理的SuperCos1相连，经噬菌体包装后侵染E.coli Trans10，构建成基因组文库，对构建成的文库的质量进行鉴定，文库随机性良好，效价为0.6×107cfu/mL，达到建库要求。这为基因簇的克隆、基因功能研究与异源表达奠定了基础。 2.结合Drimentines化学结构信息及生物信息学分析，从Streptomyces sp. OUC6819基因组扫描序列中定位了可能的Drimentines生物合成基因簇，从Streptomyces sp. OUC6819的基因组文库中克隆了该基因簇，并进行了基因组成与基因功能预测。推测该基因簇共33kb，其中包含了23个开放阅读框(Opening Reading Frames,ORFs)：driB,C,D,E,F基因可能与倍半萜结构的合成相关，driK,M,N,O,P,V基因可能参与二酮哌嗪骨架合成，driJ,L基因负责合成色氨酸，并含有driA,Q,T,W四个调控基因及可能与抗性相关的driS。通过菌落PCR对基因组文库进行筛选，筛选得到6个阳性克隆。 3.采用PCR-targeting策略，构建了用于基因driB（编码聚异戊二烯焦磷酸合酶）阻断双交换的重组cosmids，并将driB重组 cosmid转入Streptomyces sp.OUC6819中，得到了driB基因阻断突变株。采用放线菌Ⅱ号培养基对野生型菌株和△driB突变株进行发酵，发酵产物HPLC-MS检测分析表明，△driB突变株丧失了产生Drimentines类化合物的能力，证明driB基因在Drimentines生物合成中是必须的。 4.进行了Drimentines生物合成基因簇的异源表达研究。将可能包含Drimentines整个生物合成基因簇的Cos4经不同程度的修饰改造之后，通过接合转移导入天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）M1152之中，将接合子用放线菌Ⅱ号、R2YE及稀有培养基进行发酵，所得发酵产物进行HPLC分析，但未检测到Drimentines类化合物或其结构类似物的产生，推测有可能是基因未表达，或基因簇不完整。 5.初步研究了driM基因的体外催化活性。生物信息学分析表明，driM可能与Drimentines中二酮哌嗪结构的合成相关。将driM重组表达质粒导入E.coli CodonPlus(DE3)中，在16℃，0.4mM IPTG诱导条件下，实现了可溶性表达，纯化后，初步检测了其催化活性。对几种检测的氨基酸催化活力进行比较发现，DriM具有比较广泛的底物识别能力，在高浓度底物时，DriM对所测底物都表现出了催化活力。 以上研究结果为进一步展开Drimentines生物合成研究，进而采用组合生物合成及代谢工程策略实现Drimentines的结构多样化和定向高产奠定了必要的基础。
红树林链霉菌;Drimentines类化合物;生物合成;杂合结构
中国海洋大学
硕士
生药学
李文利
2013
中文
R284.3;R282.71
78
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）