单环刺螠纤溶酶III的基因克隆及表达
血栓类疾病严重威胁着人类的健康，特别是发达国家和多数发展中国家的中老年人。心脑血栓疾病不但发病率高、死亡率高、致残率高，而且具有突发性。应用溶栓药物进行血栓治疗是当前治疗血栓类疾病的主要手段。经过多年的努力探索，从尿激酶的发现到瑞替普酶的开发和蚓激酶的使用，血栓类药物的研究取得了很大进展，但仍然存在着半衰期短、特异性差等缺点，因此探索更为理想的溶栓药物一直是世界的发展目标。 本实验室经过多年的实验研究，从单环刺螠体内发现并分离出了4种新型的纤溶酶，分别命名为为单环刺螠纤溶酶Ⅰ（UFEI）、单环刺螠纤溶酶Ⅱ（UFEⅡ）、单环刺螠纤溶酶Ⅲ（UFEIII）及单环刺螠纤溶酶Ⅳ（UFEⅣ）。经溶栓实验及药物安全性的评价发现，4种纤溶酶体外溶栓效果均强于蚓激酶，并且具有较高的生物安全性，其中UFEIII因分子量小、溶栓活性高等特点，所以具有较大的开发价值。但传统的分离手段重复性差、得率低，故期望通过克隆单环刺螠纤溶酶III的基因，构建能产生重组单环刺螠纤溶酶III的基因工程菌株。本研究的主要内容有： 1.对单环刺螠纤溶酶III进行蛋白质N端测序得到该酶的N-末端氨基酸序列，根据氨基酸序列设计简并引物，经3'-RACE PCR获得该组分蛋白质的部分编码序列，进一步通过5'-RACE获得单环刺螠纤溶酶III基因的全长cDNA编码序列（共863bp），其中ORF为786bp。UFEIII全长cDNA经BLASTx比对，结果表明该基因编码产物与丝氨酸蛋白酶家族具有较高的同源性，通过 PROSITE的ScanProsite软件分析发现，该蛋白质含有一个trypsin domain，在NCBI的CDD数据库中分析结果显示该酶是一种胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶。 2.构建了原核重组表达载体pET32a-UFEIII、pGEX-6P-1-UFEIII及pET28a-UFEIII转入大肠杆菌Rosetta2(DE3)中，进行IPTG诱导，得到了重组表达的蛋白，表达后的发酵上清进行亲和层析纯化，包涵体进行复性研究，最后均获得可溶形式的目的蛋白，但未检测到活性。 3.构建了真核分泌性表达载体pINA1317-UFEIII，转入酵母Y. lipolytica Po1h中进行表达，经过大量阳性转化子的筛选，得到两株具有较高纤溶酶活性的菌株，经SDS-PAGE检测后，分子量为30kD，大于预期的分子量，分析原因是产生了糖基化的修饰。用空载上清稀释阳性菌株上清后，纤维蛋白平板测酶活，发现随着目的蛋白浓度的降低，活性也在逐渐降低，进一步证明了重组发酵液中目的蛋白的表达。 本研究首次得到了重组表达的单环刺螠纤溶酶，为后续的蛋白结构研究及药物开发打下基础，但还需进一步对原核表达条件进行探索。
单环刺螠纤溶酶III;基因克隆;组分蛋白质;编码序列
中国海洋大学
硕士
微生物学
韩宝芹
2013
中文
TQ464.8;R282.77
88
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）