迟缓爱德华氏菌侵袭与粘附相关基因的功能研究
迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）是一种革兰氏阴性致病菌，具有广泛的宿主范围，包括鱼类、两栖类、爬行类及哺乳类，给水产养殖业造成了巨大的经济损失，而且E. tarda是爱德华氏菌属中唯一可以感染人的种类。目前为止，已经报道粘附因子、对宿主免疫系统的抵抗力、铁载体、溶血素、Ⅲ和Ⅵ型分泌系统都属于E. tarda的致病因子，但是E. tarda的详细致病机制还不明确。为预防和治疗迟缓爱德华氏菌病，保障养殖业持续稳定的发展，迫切需要对E. tarda的致病机理深入研究。 在许多病原菌的致病过程中，病原菌可通过侵入宿主上皮细胞而引发系统性感染。病原菌对宿主细胞的粘附和侵袭与多种毒力因子有关，包括侵袭素、粘附素、血凝素等。侵袭素主要由革兰氏阴性致病菌产生，包括 N-端嵌在细菌外膜的β结构域和 C-端位于胞外与宿主细胞结合的结构域，在细菌侵入宿主细胞过程中发挥重要作用；粘附素与致病菌对宿主细胞的附着相关，一般包括菌毛粘附素和非菌毛粘附素；温度敏感性血凝素发现于禽病原性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC），也与细菌的致病性相关。 为了探索侵袭素、粘附素和温度敏感性血凝素在E. tarda致病性中的作用，本研究利用overlap PCR和由自杀质粒pRE112介导的二次同源重组成功构建了上述基因的缺失突变株Δinv、Δadh及Δtsh。首先，扩增inv、adh或tsh基因的上、下游片段，利用overlap PCR分别将其上下游片段连接起来，克隆测序后与自杀质粒pRE112连接，依次转入大肠杆菌SY327和S17-1，并与E. tarda野生株H1进行接合；接合子中的重组质粒与基因组发生二次同源重组后，利用含10％蔗糖的TSA平板进行筛选，得到不含自杀质粒pRE112的inv、adh或tsh框内缺失突变株。同时，将携带有inv基因全长片段及启动子区域的表达质粒pACYC184电转化进入缺失突变株Δinv，构建了inv过量表达菌株inv+。最后，分别对上述突变株和过量表达株相对于野生株E. tarda H1在生长、生物被膜形成能力、溶血活性、对EPC细胞的侵染能力、致病性、LPS合成以及胞外蛋白分泌等方面的性状改变进行了比较分析。结果表明： (1)与野生株H1相比，Δinv与inv+生长速度基本没有变化；Δinv对E. tarda生物被膜形成能力、溶血活性以及对 EPC细胞内化能力均明显降低，而 inv+则明显增强；Δinv对斑马鱼的致病性降低，而 inv+则回复到野生株的水平；Δinv与inv+对LPS的合成以及ECP的分泌没有影响。 (2)粘附素缺失突变株Δadh生长速度没有变化，但是对氨基糖苷类抗生素（卡那霉素、新霉素）和四环素类抗生素（四环素和强力霉素）的抗性相对于野生株H1明显增强，可能与外膜蛋白和脂多糖结构的改变有关；同时Δadh在生物被膜形成能力、溶血活性、对 EPC细胞的吸附能力以及对斑马鱼的致病性等方面均有明显降低。 (3)相对于野生株H1，温度敏感性血凝素缺失突变株Δtsh对细菌的生长速度无明显影响，但是对氨基糖苷类抗生素（丁胺卡那霉素，庆大霉素，卡那霉素，新霉素）的抗性增强；同时，Δtsh的生物被膜的形成能力、溶血活性以及对斑马鱼致病能力均有降低。 综上所述，inv、adh及tsh对E. tarda的致病性都发挥重要作用，它们通过影响细菌的生物被膜形成和溶血活性等方面，控制细菌对宿主细胞的粘附和内化过程，并最终影响细菌的致病性，因此均为E. tarda的重要致病因子。
迟缓爱德华氏菌;致病机理;基因功能;突变株;斑马鱼
中国海洋大学
硕士
微生物学
张晓华
2013
中文
S917.1
89
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）