壳寡糖诱导的灰霉孢子胞内活性氧动态及蛋白质差异表达研究
灰霉（Botrytis cinerea）侵染引起腐烂是造成果实采后损失的重要原因之一，目前最常用的病害防治方法是使用化学杀菌剂，但近年来化学农药滥用所引起的残留和环境污染已引起公众的广泛关注，因此，可替代的生物农药的研发成为果蔬产后领域的研究热点。壳聚糖是一种具有活性氨基和羟基的碱性多糖，有多种生物学功能，已有研究表明壳聚糖及其降解产物壳寡糖可以有效地抑制灰霉病的发生和扩展，且具有绿色环保、易降解、生物相容性等传统农药不具有的优势特点，具有广阔的应用前景。目前，对壳聚糖及壳寡糖对灰霉的抑制规律已有大量的研究报道，但关于其抑菌机理方面的认识不足，影响其未来在农业上的推广应用。本论文采用荧光标记和蛋白质组学的方法，从细胞学和生物化学角度开展了壳寡糖抑菌机制的研究，结果如下。 通过荧光分子标记技术，观察不同浓度壳寡糖单独或外源添加过氧化氢、还原剂过氧化氢酶处理对灰霉孢子内部活性氧在0，15，30，45，60，90，120，150和180min各时间点的动态变化情况。在不同浓度的壳寡糖处理中，选取0.5％和0.05%高低两种浓度，发现壳寡糖处理组与对照组在0min均存在有微弱的ROS信号，对照组在15min之后ROS信号基本消失，壳寡糖处理组ROS信号随时间延长呈现迅速下降后逐步增加的趋势，低浓度壳寡糖处理组的ROS信号略强于高浓度壳寡糖处理组，两者诱导的ROS在120min左右强度基本相同。经过50mmol/L外源过氧化氢诱导灰霉孢子1h后，发现过氧化氢诱导组与对照组相比，ROS信号明显降低，且这种差距随着作用时间的延长逐渐缩短，在120min左右实验组与对照组的ROS水平基本相同。用3mg/ml过氧化氢酶作为还原剂处理灰霉孢子，发现还原剂处理组的ROS水平明显低于壳寡糖对照组，两者的差距在60-90min达到最大，90min之后差距逐渐缩短，在180min左右ROS水平基本持平。激光共聚焦显微镜观察壳寡糖处理组与对照组的ROS在灰霉孢子内部的分布情况，发现对照组中孢子内部的ROS分布均匀且信号微弱，壳寡糖处理组中孢子内部的ROS主要分布在四周区域，中间大面积区域基本没有ROS信号的存在。活性氧荧光标记的结果表明，壳寡糖处理显著诱导了灰霉孢子内ROS水平的积累，且ROS浓度与作用时间有一定的正相关性，低浓度的壳寡糖诱导效果略好于高浓度壳寡糖；经低浓度过氧化氢诱导的灰霉孢子，在一定时间范围内，可以提高灰霉孢子对ROS的耐受能力；外源添加过氧化氢酶，可以显著降低壳寡糖对灰霉孢子内部ROS的诱导；壳寡糖处理的灰霉孢子，不仅其内部ROS水平高于对照组，而且在胞内分布不均，细胞中央位置的ROS极少分布，同时，壳寡糖诱导使灰霉孢子的内部结构发生改变。 选择浓度为0.05%的壳寡糖处理灰霉孢子8h，用Tris饱和酚抽提的方法提取灰霉孢子内部全蛋白，经过双向电泳、和图谱比对，发现差异表达蛋白质点61个，对其中28个点进行了质谱鉴定，质谱分析和数据库搜索查询，成功鉴定出23个蛋白点，共18种蛋白质，其中表达量上调的有4种，下调的有14种，除功能不明确的蛋白之外，其功能分别与物质代谢，蛋白合成，蛋白折叠，蛋白水解和信号传导有关，壳寡糖处理组与对照组相比，表达下调的蛋白数量显著多余上调的蛋白数量。蛋白质组学分析说明，壳寡糖的处理不仅降低了灰霉孢子内蛋白的合成，而且干扰了蛋白质的进一步折叠加工，使细胞内部积累了大量错误折叠的蛋白，从而促使细胞内部的正常代谢出现紊乱，并且可能导致了细胞凋亡的发生。
壳寡糖;灰霉孢子;胞内活性氧;蛋白质;差异表达
中国海洋大学
硕士
生态学
孟祥红
2013
中文
S436.6
78
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）