栉孔扇贝(Chlamys farreri)三个性腺发育相关基因的克隆及表达分析
性腺发育是发育生物学研究的重要领域之一，这是一个多基因参与调控的过程，并且受到性激素和环境等因素的影响。当前人们对于性激素在性腺发育过程中的作用已经有了很好的认知，然而，有关性激素活化和灭活的相关分子基础和机制仅在哺乳动物进行了系统的阐述。贝类是动物界中的重要类群，然而其在性激素合成和降解领域的研究却相当地不足，一定程度地限制了人们对其性腺发育和调控的理解。本研究以栉孔扇贝（Chlamys farreri）参与雌二醇、5α-雄烯二醇和5α-雄烷-3α，17β-二元醇等激素灭活的17β-HSD4和17β-HSD14为研究对象，从栉孔扇贝转录组数据库中筛选出与其它物种17β-HSD4和17β-HSD14高度同源的两个表达序列标签，采用cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆得到这两个基因的全长cDNA序列，进一步采用半定量和定量RT-PCR技术，检测了目的基因在栉孔扇贝各主要组织和不同发育时期性腺中的表达。结果如下： 栉孔扇贝17β-HSD4 cDNA全长为2417 bp，开放阅读框为2223 bp，编码740个氨基酸，推导的氨基酸序列含有SDR超家族的4个保守区和17β-HSD4的3个酶结构域，且与人等脊椎动物的序列相似性均在58％以上。半定量RT-PCR显示该基因在栉孔扇贝精巢、卵巢、肌肉、外套膜、鳃、肝胰腺和肾脏等各组织中均有表达，其中在肝胰腺和肾脏中的表达量明显高于其他组织，暗示栉孔扇贝多种组织中均可以合成17β-HSD4。定量RT-PCR结果显示，该基因在性腺不同发育时期的精、卵巢中表达模式不同；并且在生长期和成熟期的精巢中表达量显著性高于同时期的卵巢（P＜0.05）；暗示该基因对栉孔扇贝精巢发育和成熟的作用较卵巢更显著，推测该基因可能通过β-氧化调节脂类物质的积累，从而影响性腺发育。 栉孔扇贝17β-HSD14 cDNA全长为1154 bp，开放阅读框为819 bp，可编码272个氨基酸。该氨基酸序列不仅含有SDR超家族的4个保守区，还含有与17β-HSD14/NADP/estradiol三元复合物结构相对应的Lys158-Tyr154-Ser141三联体残基，且氨基酸全序列与其他物种的17β-HSD14相似性均在50％以上。定量RT-PCR结果显示，该基因在不同发育时期精、卵巢中表达的特征与17β-HSD4的类似，即在生长期和成熟期精巢中的表达量也显著性高于同时期的卵巢（P＜0.05），并且在成熟期精巢的表达量明显高于其他各时期。推测栉孔扇贝17β-HSD14可能具有羟基类固醇脱氢酶的活性，并参与雌二醇水平的调节。 进一步，我们从栉孔扇贝精、卵巢差异表达谱中筛选出10个两性差异表达的Tag片段，通过半定量RT-PCR验证，筛选出2个卵巢特异表达的Tag，4个卵巢高表达的Tag和1个精巢高表达的Tag；以其中1个卵巢中特异表达的Tag（>FTYGYVA03G8KDR）序列为基础，设计RACE引物，并扩增获得一个3'末端含有22 bp连续poly（A）的长为1142 bp的cDNA序列片段，GenBank数据库比对尚未搜索到同源序列。鉴于其在除卵巢外的栉孔扇贝其它多种组织中均不表达的特点，推测该序列可能是栉孔扇贝中参与性别分化和卵巢发育的一个未报道基因。
栉孔扇贝;性腺发育;基因克隆;定量RT-PCR技术
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
张志峰
2013
中文
Q959.1;Q785
76
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）