高效低成本全基因组DNA甲基化检测技术(MethylRAD-Seq)的建立及其在海洋贝类中的应用
DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物基因组 DNA的一种重要的表观遗传学修饰,在维持高等生物正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育、衰老以及人类肿瘤的发生等生物学过程中起着重要作用。基因组DNA甲基化通过调控基因的表达模式，参与调节机体对环境的适应过程。目前，贝类的表观遗传学研究相对比较匮乏，因此开展贝类DNA甲基化的研究有助于了解海洋无脊椎动物DNA甲基化的分子机制和功能，解析重要生长性状的基因调控机理，为贝类的遗传育种提供基础资料。 1、三种养殖扇贝基因组DNA的MSAP分析 本研究利用甲基化敏感扩增多态性（methylation-sensitive amplification polymorphism，MSAP）的方法对我国沿海三种主要的养殖扇贝品种：栉孔扇贝（Chlamys farreri）、虾夷扇贝(Mizuhopectenyesoensis)和海湾扇贝（Argopecten irradians）以及本课题组培育的“海大金贝”开展了甲基化水平和模式的研究，在贝类中建立了甲基化敏感扩增多态性方法（methylation-sensitive amplification polymorphism，MSAP）的反应体系，分析了扇贝不同种间的DNA甲基化水平及模式的差异，为贝类表观遗传学研究提供基础数据。结果表明，栉孔扇贝、海湾扇贝、普通虾夷扇贝和“海大金贝”的甲基化比例分别为32.08％、25.99%、32.88%、34.97%。几种扇贝基因组CCGG序列中胞嘧啶的全甲基化率要高于半甲基化率，推测贝类基因组中主要的甲基化模式是CpG型。 2、全基因组DNA甲基化检测技术MethylRAD-Seq的建立 鉴于已有高通量DNA甲基化检测技术在非模式生物应用的局限性，本研究开发了基于高通量测序平台的高效低成本的全基因组甲基化检测分析技术—甲基化修饰依赖性内切酶测序法（Methylation-dependent restriction-site associated DNA sequencing，MethylRAD-Seq）,该技术结合了甲基修饰依赖性内切酶和简化基因组限制性酶切分型技术（2b-RAD, type IIB Restriction site Associated DNA sequencing）的特点，在不需要基因组背景信息的前提下可以大规模发掘全基因组范围内的甲基化位点，直接获得甲基化胞嘧啶的序列信息。利用基因组背景清晰的模式生物拟南芥对 MethylRAD-Seq技术进行了方法学的验证。结果表明，MethylRAD-Seq具有很好的技术重复性，假阳性率在0.5%左右，可以检测全基因组范围内胞嘧啶的甲基化水平，并且该方法可以评估基因组染色体区域的甲基化水平分布。 3、应用MethylRAD-Seq技术研究“海大金贝”积累类胡萝卜素积累机制 利用MethylRAD-Seq技术构建12只“海大金贝”和12只普通虾夷扇贝闭壳肌的甲基化文库，测序共产生258,857,033条有效序列，数据量达9.3G。实验设计了两组技术重复，平行文库的泊松系数均能达到0.99以上，结果表明，MethylRAD-Seq技术在贝类DNA甲基化研究中的应用稳定可靠。在“海大金贝”和普通虾夷扇贝的全基因组范围内获得234,241个甲基化位点，筛选得到甲基化水平差异位点236个，对甲基化水平差异位点的GO分类注释及KEGG代谢途径分析表明，甲基化水平差异的基因参与了贝类代谢、生长繁殖、免疫以及细胞信号转导等广泛的生物学过程，同时获得与类胡萝卜素积累相关的候选基因。对“海大金贝”和普通虾夷扇贝全基因组 DNA甲基化水平差异位点的研究可以为揭示“海大金贝”类胡萝卜素积累的分子机理提供一种有效的研究手段。
高效低成本全基因组;DNA甲基化;检测技术;海洋贝类
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
包振民
2013
中文
Q959.1;Q785
60
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）