雌性牙鲆性激素合成酶相关基因SNP和DNA甲基化与繁殖内分泌相关性研究
本文以人工要养殖雌性牙鲆（Paralichthys olivaceus）为研究对象，首次分析了cyp-17Ⅱ基因甲基化位点的突变对其基因表达和繁殖内分泌的影响机理；并对cyp17-Ⅱ、Cyp19、Foxl2基因启动子和编码区CpG富集区（CpG rich region）在性腺发育期的甲基化模式对基因表达和繁殖性状的影响进行了研究和分析。 1、cyp-17Ⅱ基因甲基化位点的突变对其基因表达和繁殖内分泌的影响机理 细胞色素P450c17-Ⅱ（cyp17-Ⅱ）是影响鱼类生长，性腺分化和发育等繁殖性状的重要因子。牙鲆cyp17-Ⅱ基因编码区有三个CpG富集区。本文的目的是研究cyp17-Ⅱ外显子的突变是否发生在CpG位点上，以及这些CpG位点的突变和甲基化水平是否参与调控牙鲆cyp17-Ⅱ基因表达和繁殖内分泌。结果显示：检测到三个单核苷酸多态性，分别是：SNP1：[(c.G594A（p.Gly188Arg）]在外显子4上，称为L1位点（L1 locus）；SNP2（c.A939G）和SNP3（c.C975T），位于cyp17-Ⅱ基因外显子6的CpG富集区，称为L2位点（L2 locus）。此外，在939bp位置A→C的转变使cyp17-Ⅱ编码区增加了一个新的甲基化位点。通过多重比较分析，两个位点（L1 locus和L2 locus）都与卵巢中睾酮（T）水平（P<0.05）和cyp17-Ⅱ表达（P<0.01）显著相关。有趣的是，GG型个体在L2位点包含8个CpG甲基化位点与包含7个甲基化位点的AA型的个体相比，具有较低的睾酮水平和cyp17-Ⅱ mRNA表达含量。而且，GG型个体在938bp位置高度甲基化（≥77.8％）。这些暗示cyp17-Ⅱ编码区突变和甲基化水平可能影响雌性牙鲆基因表达和繁殖内分泌水平，并且，L2位点可以作为牙鲆育种的一个候选基因或遗传标记。 2、牙鲆卵巢发育期内cyp17-Ⅱ的甲基化水平与基因表达水平及繁殖性状相关性分析 在鱼类中细胞色素P450c17-Ⅱ（cyp17-Ⅱ,17α-羟化酶）参与卵泡成熟过程中类固醇激素的产生。繁殖周期中cyp17-Ⅱ基因的相对表达模式将有助于阐释其在性腺发育中的功能。此外，表观遗传修饰特别是DNA甲基化对基因表达调控起重要作用。本实验以成年雌性牙鲆为研究对象，采用荧光实时定量测定牙鲆性腺cyp17-Ⅱ基因的相对表达量，并检测性腺指数（GSI）、雌二醇、睾酮等繁殖生理指标。运用亚硫酸测序法测定位于编码区外显子4和6上的CpG二核苷酸甲基化水平。在性腺发育早期，cyp17-Ⅱ基因具有较低的表达水平，但最后升高。同时，睾酮和雌二醇的变化趋势与cyp17-Ⅱ基因表达趋势相一致。相反，性腺中cyp17-Ⅱ基因在每个CpG富集区整体甲基化水平从Ⅱ期到Ⅳ下降，然后升高，其变化趋势与性腺中基因表达、睾酮和雌二醇以及GSI相反。基于本研究，提出cyp17-Ⅱ可能调节雄激素和雌激素水平，从而促进卵母细胞生长与成熟，并且cyp17-Ⅱ基因的转录调控可能受编码区CpG富集区甲基化水平的影响。这些结果将有利于研究鱼类繁殖内分泌的分子调控机制。 3、牙鲆卵巢发育期内cyp19、Foxl2基因的甲基化水平与基因表达水平及繁殖性状相关性分析 本实验研究了性腺中对雌激素合成具有重要作用，并存在上下游调控关系的Foxl2基因和Cyp19a基因，从表观遗传学角度阐释Foxl2对Cyp19a基因的调控机制，以及这两种基因在卵巢发育周期中的表达机理。通过相对荧光定量检测发现Foxl2基因和Cyp19a基因均随卵巢发育期呈相同变化规律，即在Ⅱ期表达量相对较低，随后在Ⅲ期和Ⅳ期不断上升并达到最高之后在Ⅴ出现显著下降（P＜0.05）。运用亚硫酸氢盐修饰后测序法检测Cyp19a基因启动子区和编码区外显子1区域的CpG富集区甲基化模式，发现启动子区的9个CpG位点的甲基化水平随性腺发育呈现出与基因表达相反的变化趋势；其中-223bp位置的CpG二核苷酸位于cAMP反应元件结合蛋白识别序列，-141bp位置的CpG二核苷酸位于Ad4结合蛋白（Ad4BP）识别序列；而外显子1区域的CpG富集区的11个甲基化位点的甲基化水平变化趋势也与基因表达趋势成负相关性，其中有7个可能位于假定的转录因子的相应结合序列上。根据DNA高甲基化水平会抑制基因表达的原理，我们推测位于Cyp19a基因启动子区的顺式作用原件识别序列上的CpG位点的甲基化模式可能会改变转录因子与之结合的效率，从而改变基因转录效率。Foxl2可以通过直接结合到Cyp19a基因启动子区的结合序列上或者通过先与Ad4结合蛋白相结合然后再结合到启动子区的Ad4结合蛋白的识别序列上调控Cyp19a基因表达。本实验还检测了Foxl2基因编码区3个CpG富集区（依次命名为F1、F2和F3）的甲基化模式，发现其总甲基化概率与其基因表达成负相关性，这表明Foxl2基因本身的转录效率受其CpG富集区甲基化模式调控。此外，Foxl2基因保守区FH区域（fork head domain，FHD）位于F1和F2上，FHD对于Foxl2准确结合到目标基因至关重要，因此推测FHD上的CpG位点的甲基化模式的变化可能会影响其与靶基因的结合效率。总之，通过本文的研究我们可以推测出Foxl2通过其FDH结合到Cyp19a启动子区域的结合位点调控Cyp19a基因的表达；另外，Foxl2和Cyp19a基因转化效率也可能受其本身CpG富集区甲基化模式的影响。本实验结果为阐释Foxl2调控Cyp19a的调控机制提供强有力的理论依据，进一步揭示出Cyp19a和Foxl2基因对雌性牙鲆性腺发育起重要作用。 综上所述，本研究对牙鲆cyp17-Ⅱ基因编码区SNP进行检测，并对cyp17-Ⅱ、Cyp19a和Foxl2基因CpG富集区甲基化状态在卵巢不同发育进程中变化进行分析，此研究结果初步表明，性激素合成相关基因SNP和DNA甲基化状态与繁殖内分泌激素水平呈显著相关性，本研究对研究鱼类发育调控分子机理具有一定的参考意义。
雌性牙鲆;性激素合成酶;SNP基因;繁殖性能;内分泌系统;甲基化位点
中国海洋大学
硕士
水生生物学
温海深;何峰
2013
中文
S965.3;S917.4
97
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）