日本囊对虾基因组串联重复序列分析及微卫星标记的开发与应用
本文构建了日本囊对虾随机基因组文库，对片段长度为400～1000bp的3395个克隆进行测序，在此基础上分析了微卫星和小卫星在基因组上的分布特征；利用筛选的含有微卫星的克隆序列，设计和筛选出了15对微卫星多态性引物；对四个地理群体的遗传多样性进行了分析，明确了各地理群体的遗传变异水平和群体间的遗传分化程度，并对野生和养殖群体间的遗传变异进行了对比分析。具体的分析结果如下：1-基于基因组水平上的串联重复序列特征分析构建了日本囊对虾随机基因组文库，对其中片段长度为400～1000bp的3395个克隆测序，共获得总长度为1606711bp的DNA序列。序列拼接后的2815个克隆序列中，找到1206个微卫星序列和487个小卫星序列，其序列总长度分别占测序序列总长度的5.9[％]，和3.79[％]。
微卫星序列中，以两核苷酸重复的序列数目最多，约占微卫星总数的69.82％，三核苷酸重复次之，约占12.35％。两核苷酸重复中以AT重复最为丰富，约占两核苷酸重复序列总数的29.44％。低拷贝区间(≤42)的重复序列的数量大，约占微卫星总数的72.3l[％]。重复单位拷贝数的变异能力分析表明，变异系数最大的前3种重复类型，均为4～6核苷酸，重复单位越长，变异水平越高。重复单位长度与拷贝数呈负相关(r=-0.428)关系，即重复单位长度越长，拷贝数越少。AT含量大于等于50[％]的微卫星序列数目(1127)约占全部微卫星序列数目(1206)的93.45[％]，微卫星序列为富含AT序列。两核苷酸和三核苷酸重复序列按照AT含量划分重复类型，则基序AT含量与对应的重复序列数目存在着正相关，即基序AT含量越高，序列数目越多。另外，微卫星不同长度重复类型内按照GC含量划分重复类型时，当各重复类型基序GC含量在0～70％间时，两端侧翼序列GC含量与之存在着正相关关系。这可能意味着微卫星两端的侧翼序列的碱基组成对微卫星的产生和进化有一定的影响。
小卫星序列中，以十二核苷酸重复序列数量最多，以12 bp重复单位的序列数量最多(8.62％)，总体趋势表现为随着重复单位长度的增加，相应的重复序列数目降低(r=-0.826，P<0.01)。小卫星重复单位拷贝数分布范围以8bp重复拷贝数范围最广(3.1～47.6)，其次是10bp重复(2.5～44)；再次是12bp重复(2.2～28)。平均拷贝数最高的三种重复类型分别为8bp重复(13.45),32bp重复(9.32)和7bp重复(9.28)。小卫星序列中重复单位的拷贝数分布范围2～48,集中分布在2～30,且表现为随着拷贝数目的增加,其相应的重复序列数目数量递减的趋势。小卫星序列中,AT含量大于0.5的小卫星序列所占的比例为66[％],小卫星序列为富含AT序列。小卫星AT含量与相应的序列数目间,没有相关关系(r=0.063,P>0.05)。小卫星侧翼序列分析表明,随着小卫星GC含量的升高,其两端侧翼序列GC含量表现为不断增大的趋势(r=0.73 1,P<0.01),小卫星序列的产生与其两端侧翼序列的碱基组成存在一定的关系。
2日本囊对虾微卫星标记的开发
根据建立的日本囊对虾部分基因组文库,筛选其中含有微卫星序列的克隆设计引物。在2815个克隆测序序列中,总共找到了453个包含完整侧翼序列(长度大于50bp)的重复序列,比例为7.16[％]。候选引物设计序列中,以两核苷酸重复序列数目为最多,比率为64.9[％],三核苷酸重复次之(17.66[％]),然后依次是四核酸(9.71[％])、六核苷酸(7.06[％])和五核苷酸重复(1.54[％])。设计了80对引物,从中筛选出了15对微卫星多态性引物,并用这15对引物日本囊对虾广东汕头群体48个个体进行了多态性检测。电泳结果表明显示15个位点PIC值的变异范围0.6506～0.9067,均为多态位点。15个引物对的预期扩增片段长度范围在200～500bp之间,最适Tm值区间为51～56℃。。15对引物对48个个体的PCR扩增,总共获得了135个等位基因,等位基因数目的可变范围4～16。其中两核苷酸重复类型所占比例为63.7[％](86),其次是四核苷酸重复16.29[％],其余的重复类型所占比例均较小。
3日本囊对虾地理群体遗传多样性分析
通过多元异俗生长分析的方法,对福建厦门、广东汕头和广西北海日本囊对虾3个地理群体6个表型生长性状的多元异速生长系数进行了比较分析。以群体多元异速生长系数间夹角为基础数据,采用UPGMA方法构建3个地理群体的系统发生树。群体多元异速生长系数间差异的显著性检验通过置换检验来进行。研究结果表明,1st特征值所诠释的方差百分比为89.95[％]～97.20[％],表型性状数据与多元异速生长模型能够很好的拟合。群体多元异速生长系数间的夹角值表明:BH和XM群体间的夹角值(9.1810°)最大,相似度最低:XM和ST群体间的夹角值(5.2295<'。>)最小，相似度最高。UPGMA聚类分析和置换检验结果表明3个地理群体可以分为两类：XM和ST群体为一类，群体多元异速生长系数间的差异不显著(P=61.28％)；：BH群体单独划为一类，BH群体与XM和ST群体多元异速生长系数间的差异分别为显著和极显著(P=2.34％，P=0.32％)。
对广西北海(BH)、福建厦门(XM)、广东汕头(ST)和台湾海峡(TW)4个日本囊对虾野生地理群体共170个个体进行遗传多样性分析。利用6个微卫星位点扩增，共检测到85个等位基因。平均每个位点等位基因数为14.17，平均每个位点有效等位基因数为8.64。6个位点的PIC值在0.65～0.90间，平均PIC值为0.77，均为高度多态位点。4个地理群体的平均每个位点的期望杂合度以TW群体最高(H<,e>=0.8263)，BH群体杂合度最低(H<,e>=0.7441)。Hardy-Weinberg平衡检验p值表明，4个群体大部分位点存在着显著和极显著的平衡偏离现象。F<is>数据显示，4个群体的6个微卫星位点均处于杂合子缺失状态。群体间配对F<,is>值结果表明，XM、ST和Tw群体间的遗传分化程度较弱，BH群体与这3个群体间产生了中等程度的遗传分化。根据4个群体的DA遗传距离进行IJPGMA聚类，XM与ST遗传距离最小，先聚合在一起，其次是TW，最后是BH。AMOVA分析结果表明88.2697％的变异存在于群体内，组间的变异占8.7698％，各群体间的变异只占总变异的2.9605％。
对日本囊对虾野生群体与养殖群体遗传结构差异进行微卫星分析。共分析了野生和养殖群体93个体，共检测到73个等位基因。6个微卫星位点的PIC值(0.6701-0.8989)均大于标准值0.5，为高度多态位点。野生群体和养殖群体每个位点的平均等位基因数目分别为11.83和9.83，每个位点的平均有效等位基因数目分别为8.58和6.86。野生群体和养殖群体的观察杂合度和期望杂合度分别为0.5055和0.4595，0.8169和0.8209。Hardy-Weinberg平衡检验表明，两个群体中都有相当数量的位点出现了显著偏离或者是极显著偏离。野生群体和养殖群体的等位基因数目(71，59)差异的显著性检验结果表明，二者差异并不显著(P=0.296)。野生群体和养殖群体观察杂合度和期望杂合度成对样本的t检验均表明：群体间差异并不显著(P=0.689，P=0.891)。与野生群体相比较，养殖群体在遗传变异水平上并没有表现出显著降低的趋势。但是，养殖群体中出现了稀有等位基因丢失的现象。相对于养殖群体中，野生群体有14个等位基因是其所特有的；而养殖群体仅有2个群体特异性等位基因。因此，采取有效的措施，对养殖群体的遗传结构进行遗传监控，同时改良苗种繁育程序，对日本囊对虾野生资源的保护是非常有必要的。
日本囊对虾;串联重复序列;微卫星;地理群体;遗传多样性
中国海洋大学
博士
海洋生物学
王清印;孔杰
2006
中文
Q959.223.63;Q78
118
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）