一种新型海洋纤溶酶的研究
血栓性疾病是西方富裕国家人类死亡的首要原因。它主要危害心、脑、肺的血管系统,造成成年人死亡或残疾。在美国,每年大约有60万人发生肺栓塞,其中约20万人死亡:每年约有100万人发生急性心肌梗塞,其中20多万人需要住院进行治疗。在我国,每年大约有200万人死于栓塞性心脑血管疾病,每年需要进行溶栓治疗的病人超过300万。并且,这类疾病的发病率也有逐年上升趋势。
血栓性疾病的主要治疗手段是溶栓,迄今溶栓剂已发展了三代,但都有一定的副作用。有鉴于此,我们从海洋无脊椎动物单环刺蜢中寻找和分离了一种新型纤溶酶。现将主要研究结果分述如下:1.单环刺蜢纤溶酶在单环刺蜢的血液及内脏组织中含量丰富,其大量制备工艺为:体腔液及内脏混合物经匀浆、PBS抽提、(NH<,4>)<,2>SO<,4>分级盐析、超滤、Q.Sepharose Fast Flow和Sephadex G-75、Sepllacry S-100层析分离,最终获得纯酶。经过优化的本工艺可以高效率地提取这种新型海洋纤溶酶,并达到了电泳纯,在SDS-PAGE电泳图谱上显示一条带。
2.经SDS-PAGE和Native-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,单环刺蜢纤溶酶分子量约为10,380 Da。与已经发现的陆地生物来源的纤溶酶以及海洋生物来源的纤溶酶相比,分子量相对较小。而苯酚一硫酸法测定糖含量表明,单环刺 纤溶酶含糖量极低,所以可能不是糖蛋白。
3.与蚓激酶类似,单环刺蜢纤溶酶既可直接水解纤维蛋白,又具有激酶活性,通过激活纤溶酶原并使之转化为纤溶酶,从而间接地水解纤维蛋白。因而该酶具有很高的纤维蛋白亲合性和酶活力。以尿激酶为对照,测得酶的比活力为5256U/rag。
4.单环刺蜢纤溶酶体外抗凝实验结果表明,不同浓度的酶均具有显著的抗凝作用,并且酶浓度越高,抗凝效果也越好。在酶浓度相同的情况下,单环刺蜢纤溶酶的抗凝效果要优于蚓激酶。而且,单环刺 纤溶酶作用相对温和,对细胞损伤小。与此相比，蚓激酶对个别红细胞的细胞膜具有一定程度的损伤作用。
5.单环刺蜢纤溶酶体外溶解兔血栓实验表明，不同浓度的酶均具有显著的溶栓作用，并且酶浓度越高，溶栓效果也越好。在酶浓度相同的情况下，单环刺蜢纤溶酶的溶栓作用效果要优于蚓激酶。而且，单环刺蜢纤溶酶对细胞损伤相对较小。与此相比，蚓激酶对个别红细胞的细胞膜具有一定程度的损伤作用。这一实验结果在wiStar大鼠血栓溶解实验中也得到了证实。
6.在37℃条件下，单环刺<虫 益>纤溶酶、蚓激酶与新鲜兔血栓作用2h后的血栓溶解率实验结果为：蚓激酶50.66％；单环刺虫益纤溶酶89.76％。单环刺蜢纤溶酶的血栓溶解率显著超过蚓激酶。
7.以酪蛋白为底物，当底物浓度小于0.1％时，酶反应速度随底物浓度增加而增加；当底物浓度约为0.1％时，酶反应速度最大；而当底物浓度超过0.1％时，酶反应速度随底物浓度增加反而下降，显示出底物浓度对单环刺<虫益>纤溶酶具有显著的抑制作用，其机理与反竞争性抑制类似。
8．以酪蛋白为底物，根据双倒数作图法(Lineweaver-BLirk plot)求出的酶反应的动力学常数为：Km=0.05：Vmax=3.08 mol／min。
9.理化性质研究表明，单环刺缢纤溶酶具有较高的稳定性。当温度在50℃以下时，3 h内酶的活性基本保持不变。该酶在10种不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)的缓冲液中于4℃放置24 h后，酶的活性相当稳定。尤其是在偏碱性的pH范围内，酶的活性更好。当pH为11时，4℃放置24 h后的残余酶活力为96％，然而当pH继续增加，残余酶活力开始下降。
10．单环刺蜢纤溶酶的最适反应温度约为50℃。酶在pH 7.5～pH 8.5的偏碱性环境中活力最好，可能是动物在长期进化过程中与环境相适应的结果。
11．在实验中发现，Fe<'3+>和Ag<'+>离子是单环刺蜢纤溶酶的抑制剂，而Fe<'2+>、Mn<'2+>和Cu<'2+>离子是该酶的激活剂，其他参与实验的金属离子，包括Mg<'2+>、Ca<'2+>、zn<'2+>、Li<'+>、 Fe<'25+>、 Ba<'2+>、 K<'+>、Na<'+>，在0.01 mol/L时对该酶活性的影响不显著。
12．Fe<'2+>和Fe<'3+>离子有可能在单环刺<虫益>体内负责调节纤溶酶活性。当Fe<'2+>离子浓度从0.001 tol/L提高到0.01 mol/L时，残余酶活力略有增加，而当浓度继续增加到0.1 m01/L时，残余酶活力急剧提高到原先的5.5倍。与此相反，当Fe<'3+>离子浓度为0.1 mol／L和0.01 mol／L时，残余酶活力保持不变，而当浓度继续下降到0.001 mol／L，残余酶活力开始明显增加。
综上所述，由于单环刺蜢纤溶酶分子量小、稳定性高、抗凝及溶栓活性强、对细胞损伤小等优势，在临床上将具有很好的应用前景。
单环刺螠;纤溶酶;溶栓剂;海洋药物
中国海洋大学
博士
海洋生物学
刘万顺
2006
中文
Q178.53
142
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）