牙鲆促性腺激素释放激素及其免疫影响的研究
促性腺激素释放激素(GnRH)是下丘脑-垂体-性腺轴的关键信息分子，在脊椎动物生殖神经内分泌调控中特别是在刺激促性腺激素的合成和释放方面具有至关重要的调节作用，是神经-免疫-内分泌三大调节系统之间互相联系的信使之一，鱼类GnRH及其受体结构和生物学功能逐渐成为神经内分泌和生殖生物学研究的热点之一。牙鲆(Paralichthys olivaceus)，属硬骨鱼纲，鲽形目，鲆科(Bothidae)，是中国重要的海水养殖鱼类，关于牙鲆GnRH及其受体的分子生殖内分泌研究未见报道，了解牙鲆GnRH及其受体的类型、分布和作用，对阐明牙鲆神经-生殖-内分泌的相互调控具有有十分重要的意义。本论文的研究结果如下：
(1)本文采用免疫组织化学技术检测了GnRH和NPY在性成熟牙鲆组织内的分布。表明：GnRH阳性细胞分布于脑、垂体、胃、肠、卵巢等神经、消化和生殖器官；NPY在延脑、大脑、卵巢中检测到了阳性反应细胞。
(2)采用RACE技术获得牙鲆607 bp全长cGnRH-II cDNA，编码95个氨基酸的前体肽。该cGnRH-Ⅱ前体肽包含有23个氨基酸残基的信号肽、cGnRH-Ⅱ成熟十肽(QHWSHGwYPG)、一个3肽(Gly-Lys-Arg)加工位点和49个氨基酸残基的促性腺激素释放激素相关肽(GAP)。前体氨基酸序列同源性分析表明，牙鲆cGnRH-Ⅱ前体与条斑星鲽(barfin flounder)相似性最高为97.6％，其次是军曹鱼科、丽鱼科和鲷科鱼类；与哺乳动物、爬行动物和两栖动物同源性较低。RT-PCR检测显示，cGnRH-Ⅱ基因在牙鲆肾脏、脑、垂体、鳃和卵巢中表达；以肾脏中表达水平最高。
(3)克隆获得了牙鲆395 bp全长sbGnRH cDNA，编码98个氨基酸的sbGnRH前体。该sbGnRH前体肽包含有26个氨基酸残基的信号肽、sGnRH成熟十肽(QHWSYGLSPG)、一个三肽(Gly-Lys-Arg)加工位点和59个氨基酸残基组成的GAP。前体氨基酸序列同源性分析表明，牙鲆sbGnRH与条斑星鲽的同源性最高为86.7‰RT-PCR检测显示，sbGnRH基因在牙鲆脑、胃、脾脏、眼、垂体、肌肉、肠、卵巢中皆有表达。
(4)利用3'-RACE技术克隆得到了牙鲆391 bp sGnRH cDNA 3'-末端片段序
列，该片段预测能编码61个氨基酸残基的不完全sGnRH前体肽，包含有sGnRH十肽的后4个氨基酸残基“WLPG”、一个3肽(Gly-Lys—Arg)加工位点信号和54个氨基酸残基的GAP。sGnRH 3’-末端cDNA含有205 bp的3’-UTR。
(5)利用RACE和nest-PCR．结合技术克隆获得了牙鲆1671 bp GnRH-R全长cDNA序列，包含147 bp的5’-UTR、1248 bp ORF和276 bp的3’-LJTR，编码415个氨基酸。结构域预测表明，牙鲆CmRH-R含有7个跨膜结构域，属于G蛋白偶联受体家族A视紫质样(Rhodopsin-like)亚家族，具有典型的G蛋白偶联受体特征：包含1个胞外N．末端尾巴、3个胞外loop、3个胞内。loop、由ECLs和ICLs连接的7个跨膜α螺旋以及1个胞内C-末端尾巴。GnRH受体进行蛋白活性位点搜索发现，牙鲆GnRH受体具有多个糖基化位点、酪蛋白激酶II(CK II)、磷酸激酶C(PKC)和磷酸激酶A(PKA)磷酸化位点，这些位点对于GnRH-R．的活性和偶联反应具有重要功能。RT-PCR检测表明牙鲆GnRH-R mRNA在脑、睾丸、肾脏、眼睛和卵巢中均有较强的表达。
(6)本文探讨了GnRH类似物(GnRH-A．)对活体牙鲆垂体中GnRH-R、GtHα、GtHI-β、GtHII-β和GH中转录水平的影响，试验结果表明，GnRH-A能够诱导牙鲆GnRH-R．、GtHα、GtHI-β、GtHII-β和GH mRNA表达水平的升高，分别在处理后6h、12h、36h、12h和12h达到高峰。
(7)采用离体培养和活体实验相结合的方法，研究了CmRH-A对牙鲆淋巴细胞分泌IL-2的影响。体外实验结果表明，低浓度(10<'-3>、10<'-9>、10<'-10>M)的GnRH-A能够显著诱导IL-2的分泌；活体实验显示，在处理1周(W)后，血清中IL-2的含量开始增加，呈上升趋势，4 W时达到最高；在处理后第1、2、3、4 W时，处理组与对照组IL-2含量存在显著性差异(p<0.05)。
牙鲆;促性腺激素释放激素;基因克隆
中国海洋大学
博士
海洋生物学
孙修勤
2006
中文
Q575.12;Q959.478
160
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）