南极嗜冷菌Marinomonas sp. NJ522的低温超氧化物歧化酶及其生境适应性研究
极端微生物在极端环境长期适应过程中形成了独特的性质。对它们的研究不仅对了解生命的极限、进化与分类等具有重大理论价值，而且对环境污染、生态、微生物新功能等具有重要的实际意义。近年来南极微生物的低温催化活性和环境适应性受到人们的极大关注。超氧化物歧化酶是生物体防御氧化损伤的一种十分重要的生物酶，是抗氧化酶系统中最重要的组成酶。它是唯一以超氧阴离子自由基为底物的酶，可以催化超氧阴离子的歧化反应产生分子氧和过氧化氢，在南极细菌对恶劣环境的适应中具有重要作用。目前对南极低温酶的研究日益增多，但对南极微生物低温超氧化物歧化酶的研究还尚未见报道。
本研究从南极细菌中筛选产低温超氧化物歧化酶的菌株Marinomonas sp．NJ522，并研究影响超氧化物歧化酶产量的因素、进一步优化产酶条件，对南极细菌Marinomonas sp．NJ522超氧化物歧化酶进行分离纯化，得到均一产品，详细阐明该酶的性质。并以Marinomonas sp．NJ522为材料从生化组成(脂肪酸和蛋白质)及抗氧化酶的角度，进一步阐明南极细菌的环境适应机制(包括低温、高盐和重金属)，以期为获得超氧化物歧化酶的新来源，并且进一步探明南极细菌对胁迫的适应机制提供科学依据。
(1)参照超氧化物歧化酶活力和生物量两个指标，从421株南极细菌中筛选出高产超氧化物歧化酶南极细菌NJ62、NJ379、NJ522和NJ548。它们的最适生长温度在10～15℃之间，在0℃均能生长，都属于嗜冷菌。它们所产的超氧化物歧化酶均属于低温酶。4株南极嗜冷菌均含有一种类型的SOD同工酶。NJ62的超氧化物歧化酶为Mn-SOD；而NJ379，NJ522和NJ548的超氧化物歧化酶均为Fe-SOD。可见，南极嗜冷菌有可能成为超氧化物歧化酶的新来源。
(2)通过形态学观察和16S rDNA序列对4株产低温超氧化物歧化酶的南极嗜冷菌NJ62、NJ379、NJ522和NJ548进行鉴定。结果表明，它们均属于细菌域(Bacterial)中的紫细菌类群(Proteobacteria)中的r-亚群。其中菌株NJ62属于交替单胞菌目(Alteromonadales)，交替单胞菌科(Alteromonadaceae)，假交替单胞菌属fPseudoalteromonas sp)；NJ379属于交替单胞菌目(Alteromonadales)，希瓦氏菌科(Shewanellaceae)，希瓦氏菌属(JShewanella sp)；NJ522和NJ548属于假单胞菌目(Pseudomonadales)，海螺旋菌科(Oceanospirilines)，海单胞菌属(Marinomonas sp．)。
(3)以南极嗜冷菌Marinomonas sp．NJ522为材料，测定培养条件和营养因子对南极嗜冷菌NJ522生长和超氧化物歧化酶的影响，并在摇瓶培养条件下对南极嗜冷菌NJ522产超氧化物歧化酶的条件进行优化。研究结果表明：通气量越大，菌株的生物量和SOD的活性越高；最适接种量4％，最适初始pH 7.0，最适温度为10V，葡萄糖为最优的碳源，蛋白胨为为最佳氮源。在单因素水平的基础上，优化的嗜冷菌NJ522摇瓶发酵SOD的最适条件为：培养基中蛋白胨为7.5 g／L，葡萄糖为15 g／L，酵母提取物1g／L，NaCl 1g／L，1000 ml陈海水，初始pH 7.0，于10℃，以120 r／min转速，振荡培养120 h。
(4)以硫酸铵沉淀、离子交换和凝胶过滤等方法，对南极嗜冷菌NJ522超氧化物歧化酶进行分离纯化。结果表明，南极嗜冷菌NJ522的超氧化物歧化酶总蛋白0.8mg，总纯化倍数达38倍，总回收率为9％，酶的比活力为5 652tJ／mg，电泳表明达到均一性。离子交换对南极嗜冷菌NJ522 SOD具有较好的分离效果，这是得以分离纯化的关键步骤。超氧化物歧化酶的分子量为47.9kDa，由两相同的亚基组成，与已知来自其他微生物超氧化物歧化酶的大小相似。
(5)南极嗜冷菌NJ522 SOD具有Fe-SOD的典型特征。其活性受H202的抑制，而不受KCN的影响；可见和紫外光谱在280nm和380nm处有最大吸收峰。南极嗜冷菌NJ522 SOD在pH7.0～10.0具有较高活性，其最适pH为8.0，与其它SOD极相似；在pH6.0～10.0的环境中超氧化物歧化酶比较稳定，强酸性对其影响比较大。南极嗜冷菌NJ522 SOD的最适温度为40℃，在0℃时仍有一定活力，表明它是一种低温酶。此外，它的热稳定性较差，活化能为25.6 kJ／mol。表面活性剂SDS和Tween-80对南极嗜冷菌NJ522 SOD均具有抑制作用。碘乙酰氨和溴乙酸抑制SOD的活力，PMSF可以提高SOD的活力。螯合剂不同程度地抑制SOD的活力，DTT、巯基乙醇、尿素和硫脲可以提高SOD的活力。．Zn<'2+>、Mg<'2+>和Ba<'2+>对SOD有促进作用；pb<'2+>、cd<'2+>、Fe<'3+>和A1<'3+>可以抑制SOD的酶活。(6)南极嗜冷菌NJ522主要由11种脂肪酸组成，其脂肪酸成分和组成受环境因子影响较大。低温(-2℃)处理后长链脂肪酸增多，饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的含量明显下降，而多不饱和脂肪酸的含量明显升高。高盐度(99)处理后短链的脂肪酸增多，脂肪酸成分大量减少，饱和脂肪酸主要为C14：O、C16：0和C18：O，单不饱和脂肪酸为C16：1，多不饱和脂肪酸为C18：3(71)和C18：3(α)；总饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的含量上升，但多不饱和脂肪酸的含量下降。成冰处理(温度-2℃，盐度99‰)的脂肪酸成分和组成变化不大。南极嗜冷菌NJ522蛋白质组成受环境因子影响较大。低温处理后在50kDa左右增加一条蛋白质带。高盐处理后大量的蛋白质条带变弱或消失，可以清楚地看出中蛋白质带在b处(约80kDa)和c处(约80kDa)基本消失，变化蛋白条带分子量范围比较宽；此外没有发现诱导新的蛋白质条带出现。成冰处理组的蛋白质组成无明显变化。可见脂肪酸和蛋白质成分组成变化，是与南极嗜冷菌NJ522的生存环境适应性的。
(7)在环境因子低温(-2℃)、高盐度(99)和成冰(温度-2℃，盐度99)骤变情况下，在较短时间内嗜冷菌NJ522会产生大量的活性氧自由基，从而对细胞的膜系统产生伤害；但嗜冷菌NJ522在短时间内能够迅速恢复保护酶的活力，消除活性氧自由基并修复损伤的膜系统。在环境因子骤变情况下，嗜冷菌NJ522中的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶的活性明显比对照组的高。正是这保护酶系统和高的酶活性，保护嗜冷菌NJ522细胞的膜系统不致受到伤害，得以在南极海冰恶劣环境生存。
(8)随着人类活动的加强，Hg已经出现在南极，它可以在食物链中积累，是一种毒性强且非常普遍的重金属污染物。本文研究Hg对南极嗜冷菌NJ522的生长及其抗氧化酶等相关酶的影响，以阐明超氧化物歧化酶等抗氧化酶在其重金属适应中的作用。测定表明Hg能在南极嗜冷菌NJ522中富集，并引起NJ522生长速度减慢、丙二醛含量增加，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶和汞还原酶活力得到提高，可见抗氧化酶系统在抗重金属胁迫中也具有作用。这些参数可以用来反映Hg或其它重金属污染对南极生物圈的生物学影响。
综上所述，南极嗜冷菌NJ522产低温超氧化物歧化酶，并且活性较高；通过条件优化，有望使南极嗜冷菌NJ522在超氧化物歧化酶生产上成为可能。南极嗜冷菌NJ522超氧化物歧化酶的分离纯化，表明它与其它来源的超氧化物歧化酶具有异同点，且具有典型低温酶的特性，这对超氧化物歧化酶资源和低温酶适应机制等方面的研究具有重要意义。南极细菌在长期进化过程中已形成了相应的适应机制，脂肪酸和蛋白质成分组成发生变化，以超氧化物歧化酶为主的抗氧化酶系统在对抗低温、高盐和Hg的胁迫中具有重要作用，这对南极细菌在海冰中的生存具有重要的意义。
南极嗜冷菌;低温酶;超氧化物歧化酶;生境适应性
中国海洋大学
博士
海洋生物学
李光友;缪锦来
2006
中文
Q938.8
145
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）