南极适冷菌Pseudoalteromonas sp.S-15-13胞外多糖的研究
南极海洋环境寒冷,一些区域终年覆盖冰雪。空间的特殊性和每年海冰形成活动中季节的大幅浮动,使微生物栖息环境具有高度的多样性,进而形成了不同的微生物群落。生存于南极生态系统中的微生物的多样性是开发具有特殊应用价值的活性物质(包括EPSs)的资源库。南极海冰中发现了大量的微生物(海冰微藻和细菌)及其产生的胞外多糖,这些物质聚集在冰藻和细菌生存的海冰通道中,提供了海冰和冰水界面的有机碳,是能源传输的主要物质;并且还可以保护细胞在结冰时免受冰晶的伤害,缓冲pH以及盐浓度的变化,可以降低其它化学物质的伤害。南极微生物的胞外多糖在南极生态系统中具有重要的意义,然而,南极微生物胞外多糖的免疫活性和潜在的生物生化应用价值尚未见报道。因为一些胞外多糖具有重要的生物及医用价值,如潜在的抗肿瘤、免疫调节以及降血糖等特性。为此寻找分泌特殊应用价值胞外多糖的微生物(包括极地微生物)的工作已经广泛展开。本研究以中国第十九次南极科学考察采集的海水海冰样品中的57株南极细菌为材料,通过胞外多糖的染色方法筛选出27株产糖菌;其中一株高产糖南极海洋菌S-15-13经16S rDNA鉴定确定为假交替单胞菌属;通过对该菌的培养条件的研究以及对其胞外多糖的分离纯化获得纯度较高的样品;采用气相色谱(GC)、红外光谱(IR)、甲基化分析、1维和2维核磁共振氢谱(<'1>H-NMR)、碳谱(<'13>c-NMR)分析确定多糖EPS-Ⅱ的结构;对多糖EPS-Ⅱ的体外免疫活性以及对荷瘤(S180)小鼠的免疫增强作用进行研究;对该胞外多糖的低温适应机制以及低温保护作用进行初步探讨,以期为南极细菌的适冷机制以及南极资源的开发利用提供科学依据。
1.通过对57株南极菌的外形观察结合CHRISTENSEN法、刚果红法和显微镜检测法共筛选出产胞外多糖的菌株27株。 16S rDNA鉴定结果表明,南极海洋菌S-15-13是一株假交替单胞菌Pseudoaltermonas sp.S-15-13。由于假交替单胞菌是南极生态系统中最常见也是很重要的一类细菌，所以对其进行进一步的研究。南极海洋菌Pseudoaltermonas sp．S-15-13的外形观测结果为：细胞呈杆状，长度为1.0×2.8(u m)，极生鞭毛可以运动。生理生化鉴定结果表明，南极海洋菌．Pseudoaltermonas sp．S-15-13革兰氏染色阴性，兼性厌氧，氧化酶、接触酶、尿素酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶反应呈阳性：硝酸盐还原反应、吲哚试验、明胶液化试验、H<,2>S试验、MR试验、VP试验、ONPG试验、鸟氨酸脱羧酶反应均呈阴性。
2．对南极海洋菌S-15-13的实验室培养条件进行的研究结果表明，南极海洋菌S-15-13可以产生胞外多糖，最佳产糖条件为：培养时间，56h；温度，8℃；最佳碳源，浓度为1％的葡萄糖；最佳NaCl浓度，3％；最佳pH值6-7。试验结果表明，南极海洋菌在4～25℃下均能正常生长，因此确定该菌为适冷菌，即南极适冷菌S-15-13。100L发酵罐结果表明，可以利用外接冰水作为循环水来控制发酵罐内温度，从而保证南极适冷菌S-15-13正常生长，其它条件与实验室培养条件大体相同，胞外多糖的产量与实验室发酵相比有所提高。
3．南极适冷菌S-15-13发酵液经乙醇沉淀、去蛋白后获得粗多糖。多糖粗品经DEAE．Sephadex A-50离子交换层析初分获得两个组分EPS-Ⅰ和EPS-Ⅱ，分别经Sephadex G-100凝胶层析进一步纯化，均获得对称的单一峰。冷冻干燥的样品经碘．碘化钾反应、双缩脲反应、α-萘酚显色(Molish)反应、UV以及HPLC检测，无蛋白、核酸、小肽及其它杂质存在；表明样品纯度较高，符合进一步分析和研究的要求。以高效凝胶渗透色谱(HP-GPC)测定两个多糖组分EPS—Ⅰ和EPS-11分子量分别为：23kDa和62kDa。
4．对南极适冷菌S-15-13胞外多糖的单糖组成以及结构进行分析。GC分析结果表明，胞外多糖EPS-Ⅰ由D-甘露糖、D-葡萄糖和D一半乳糖组成；EPS—Ⅱ仅由D-甘露糖组成；经红外光谱(IR)，甲基化分析、lD和2 D核磁共振分析，确定EPS-Ⅱ的单糖构型及其连接方式如下：
α-D-Man···-α-D-Man(1→2)一α-D-Man(1→2)-α-D一Man(1→2)···
5．体外细胞免疫试验结果表明，南极适冷菌S-15-13的胞外多糖能够显著的提高小鼠脾淋巴细胞的转化率，同Con A联合使用的效果更好；胞外多糖EPS-Ⅱ能够激活小鼠腹腔巨噬细胞，提高Mφ吞噬异物的能力。肿瘤抑制试验结果表明，胞外多糖EPS-Ⅱ，能够显著地抑制肉瘤S180的增长，最高抑制率可达到45.1％，并且显著提高脾重，降低肿瘤细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞的表达，增加脆性组氨酸三联体(FHIT)以及S-100阳性细胞的表达。EPS-Ⅱ抑制肉瘤S180的机制，可能与影响PCNA、FHIT、和S-100的表达有关。
6.对南极适冷菌S-15-13胞外多糖的低温保护作用的测定表明，南极适冷菌S-15-13胞外多糖在不同的浓度下，均可以降低溶液的冰点，降低冰点的作用较相同浓度的葡聚糖明显。研究结果还表明，胞外多糖可以保护菌体免受重复冻融对其造成的伤害作用，在重复的冻融循环后，仍能保证该菌保持较好的生长能力，因而推测该胞外多糖具有一定的低温保护作用。
综上所述，南极适冷菌S-15-13的胞外多糖EPS-Ⅱ是由(1,2)α-D-Man组成主链，并在6位上有分支的甘露聚糖；该糖在体外具有很高的细胞免疫活性，而且能够提高荷肉瘤S180小鼠的免疫机能；同时，该菌最佳产糖温度为8℃、盐度为3％，其产生的胞外多糖还能够降低冰点，避免重复冻融对菌体的伤害作用。本结果为研究南极微生物的低温适应机制，以及南极资源的开发利用提供了科学依据。
南极适冷菌;胞外多糖;免疫活性;低温保护
中国海洋大学
博士
海洋生物学
李光友;陈靠山
2006
中文
Q939.11;Q178.53
128
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）