条斑紫菜cDNA微阵列制备与应用及锰超氧化物歧化酶基因克隆与序列分析
紫菜是一种重要的海洋红藻，目前全世界报道的紫菜约有134种。条斑紫菜(P．yezoensis Ueda)是太平洋西部特有的物种，主要分布于中国、日本和朝鲜半岛，为目前最具经济价值的栽培海藻之一。条斑紫菜是潮间带藻类的代表性模式物种，其基因组较小(碱基数目为10<'8>数量级)，染色体数目少(配子体仅3条染色体)，能够在实验室条件下完成生活史，遗传转化系统研究亦取得了初步的进展，这些特性使条斑紫菜成为遗传学、分子生物学和基因组学研究的好材料，具有很高的科学研究价值。
近年来，条斑紫菜相关研究进展迅速，取得了一批创新性的成果，国内外学者先后发布了2万余条斑紫菜表达序列标签(ESTs)，克隆了一批重要的功能基因，为深入了解条斑紫菜遗传特性提供了条件。EST大规模测序技术和基因表达谱芯片技术，具有高通量快速性的特点，可以同时处理分析大量实验样本，在生物功能基因组研究中发挥了巨大的作用，它们已被广泛应用于组织特异性基因表达谱分析、新基因的克隆以及基因组序列的功能注释等许多研究领域。因此，我们借鉴其它生物成功的经验，利用实验室已建立的条斑紫菜表达基因文库EST进行序列分析，构建条斑紫菜表达谱基因芯片，可以在较短时间内获得较多的条斑紫菜功能基因表达信息，帮助我们获得与重要性状相关的差异表达基因。
我们对得到的1465条ESTS进行生物信息学分析，最终确定467个代表单个基因的ESTS制备cDNA表达谱芯片。分别提取配子体和孢子体世代条斑紫菜RNA，在反转录的过程中标记荧光与芯片杂交，经过扫描和背景均一化得到结果。对微阵列扫描结果进行分析，在467个基因点当中，在配子体中表达上调的基因有55个，其中有21个基因与已知功能基因或假定功能基因相匹配；在孢子体中表达上调的基因有86个，其中能与已知功能或假定功能基因相匹配条斑紫菜cDNA微阵列制备与应用及锰超氧化物歧化酶基因克隆与序列分析的基因有24个。表达丰度发生改变的基因包括了胁迫应答，核酸代谢和蛋白质代谢等多个方面。本研究中，利用自主研制的功能微阵列检测发现，条斑紫菜配子体和孢子体间存在显著的基因表达差异。比较微阵列检测结果与已公开的2万多条条斑紫菜．ESTS在不同世代中的分布频率，可以看出二者间有较好的一致性，也证明了所研制微阵列在紫菜功能基因研究中具有较高的可靠性。抗氧化酶类在植物抗逆防御中具有重要作用，为研究紫菜抗逆的分子机制，根据条斑紫菜(P.yezoensis)表达序列标签和全长cDNA富集文库为基础，采用PCR技术，克隆了条斑紫菜编码锰超氧化物歧化酶(manganese superoxidedismutaSe，Mn-SOD)的cDNA及基因组DNA全长序列。研究结果表明：该基因cDNA序列全长为958个核苷酸，包含一个完整：Mn-SOD基因的ORF，编码224个氨基酸和终止密码子；该基因在基因组中序列长度为1416bp，包含4个外显子和3个内含子，这既不同于高等植物的6个外显子和5个内含子，也不同于人的5个外显子和4个内含子；该基因编码区密码子的平均GC含量为60.9％，第三位密码子的GC含量高达84.9％；序列中包含四个与Mn<'2+>的结合位点及一个保守的金属结合结构域，预测分子量为24469.09Da，等电点为5.99；条斑紫菜Mn-SOD与人的相关蛋白具有类似的空间结构，都有6个跨膜α螺旋结构域；由cDNA序列推导的氨基酸序列与莱茵衣藻(C7hlamydomonasreinhardtii)相似性为57.7％，系统发生分析表明条斑紫菜Mn-SOD与绿藻莱茵衣藻和硅藻海链藻的亲缘关系较近。
本论文的研究，加深了对条斑紫菜重要性状的遗传基础的认识，为选育具有抗病、抗逆、高品质等优良性状的条斑紫菜新品种提供了有价值的信息，有利于推动紫菜产业的持续健康发展。
条斑紫菜;cDNA微阵列;差异表达基因;锰超氧化物歧化酶基因;序列分析;基因克隆
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
茅云翔
2006
中文
Q785;Q949.292.1
65
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）