两株海绵来源真菌抗肿瘤活性成分研究及宏基因新技术在海绵共附生菌中应用初探
海绵共附生微生物因其次级代谢产物结构新颖、活性独特，目前已成为抗肿瘤药物研究的重要资源。本文对两株海绵来源的抗肿瘤活性真菌黄灰青霉Penicillium auratiogriseum(Sp－19)和菌株CTFS－15的抗肿瘤活性次级代谢产物进行了较系统地研究。此外，本文还对利用宏基因技术从未培养海绵共附生微生物中寻找生物活性代谢产物的方法进行了初步探索。
对黄灰青霉P．auratiogriseum(Sp－19)和菌株CTFS－15分别进行大量发酵，发酵液经乙酸乙酯萃取得粗提物；采用人慢性髓性白血病K562细胞，以细胞增殖抑制活性结果为分离向导，采用减压硅胶柱层析、凝胶柱层析(SephadexLH－20)、反相硅胶柱层析(RP-18)和反相制备高效液相(HPLC)等分离手段，从两株真菌的乙酸乙酯提取物中分离得到27个化合物；利用理化性质和光谱学方法(uv、IR、MS、1D-NMR和2D-NMR)鉴定了其中23个化合物。其中分离自黄灰青霉P.auratiogriseum的18个化合物分别为：Auratiomide A(1)，Auratiomide C(2)，Anacine(3)，FructigeninesA(4)，Fructigenines B(5)，PseurotinA(6)，青霉菌素(7)，青霉菌醇(8)，Viridicatol(9)，3-甲氧基4-苯基喹啉酮(10)，3-甲基喹唑啉酮(11)，(2s，4S)-2,4,8一trihydroxy-3，4-dihydronaphthalen-1(2H)-one(12)，( 2S，4R)-2,4,8-trihydroxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2h)-one(13)，(3R，4R)-3,4,8-trihydroxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one(14)，麦角甾醇(15)，N-(2-羟苯基)乙酰胺(16)，N-(2-(甲氨基)苯基)乙酰胺(17)和大黄素(18)；分离自菌株CTFS-15的5个化合物分别为：过氧化麦角甾醇(19)，对羟基苯乙酰胺(20)，7-羟基-4-甲氧基-5-甲基香豆素(21)，环-(丙-亮)(22)，靛红(23)。
利用人(K562、A549、BEL．7402、HL-60)及小鼠(tsFT210、P388)肿瘤细胞，以细胞增殖抑制率、细胞凋亡诱导和细胞周期抑制活性为指标，应用流式细胞术、SRB等方法对分离得到的化合物进行抗肿瘤活性的初步评价。结果表明，化合物1、2、3、4、5、6、7、8、ll、12、13、14、16、23对K562细胞具有不同程度的细胞增殖抑制活性，化合物15、19对tsFT210细胞具有强烈的坏死性细胞毒活性。进一步研究表明，化合物8、20对K562细胞具有细胞凋亡诱导活性，化合物3、18对K562细胞具有细胞周期的G<,0>／G<,1>期抑制活性，化合物23对P388细胞具有细胞周期的G<,2>／M期抑制活性。其中，化合物7、8、11、12、13、14、16、20、23对K562细胞的活性为首次报道；化合物23对P388细胞的G<,2>／M期抑制活性为首次报道。对于黄灰青霉Pauratiogriseum，生物碱类化合物1、2、3、4、5、6、7、8、ll和四氢萘酮类化合物12、13、14是其抗肿瘤活性的主要结构类型。对于菌株CTFS-1 5，化合物19、20、23是其主要抗肿瘤活性成分。
在利用宏基因技术开拓未培养海绵共附生微生物药用资源的研究中，直接提取海绵共附生微生物基因组DNA构建了转基因工程菌，从中随机筛选到2株能够抑制四联球菌生长的工程菌，利用高压液相色谱对其代谢产物进行了分析，结果显示，工程菌的高压液相指纹图谱与宿主菌的存在明显差别，这说明工程菌中产生了不同于宿主菌的代谢产物。以上结果证明了通过宏基因技术构建工程菌来寻找未培养海绵共附生微生物活性代谢产物这一新途径从方法学和实验技术上来说都是可行的。
综上，本文通过对两株海绵来源真菌的次级代谢产物进行研究，初步阐明了黄灰青霉P. auratiogriseum(Sp-19)和菌株CTFS-15抗肿瘤活性的物质基础，确定了活性成分的主要结构类型。此外，本文还首次对利用宏基因技术研究海绵中未培养微生物活性代谢产物的方法进行了初步探讨，为今后开拓海洋天然产物资源，提供了很好的研究思路和途径。
海绵共附生微生物;次级代谢产物;抗肿瘤活性;基因组DNA;活性跟踪分离
中国海洋大学
硕士
药物化学
顾谦群;朱伟明
2006
中文
R282.77
79
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）