鱼类精子及胚胎超低温冷冻保存
鱼类精子超低温冷冻保存研究已经在上百种鱼获得成功.但是,在数万种鱼当中,这只是其中极小的一部分.另外,目前鱼类精子冷冻保存所报道的方式方法多种多样,迫切需要建立比较规范的、相对统一的技术路线.在反复实验研究的基础上,我们建立了重要底栖经济鱼类——牙鲆(Paralichthys olivacelus)和圆斑星鲽[Verasper variegates (T & S)]精子超低温冷冻保存的简便易行、效果优良、便于实际应用的技术方案.从冷冻保存前后的精子运动率检测,一直到解冻精子授精率和胚胎孵化率检测等形成了比较系统、相对规范的技术路线.在鱼类胚胎冷冻方面,首先以优化筛选低毒高效的冷冻保护稀释液为目标,对不同浓度的5种常用的冷冻保护剂在胚胎发育的正常温度(16℃)下对牙鲆胚胎的毒性做了检测.结果显示,凡是配合有20﹪或5﹪MeOH的混合保护剂溶液对牙鲆胚胎的低温保护作用都显著优于单一保护剂的效果,而除MeOH以外的其他4种保护剂之间的所有配合都未发现这种效果.说明在选用了一种较为理想的冷冻保护剂后,再加上一定比例的MeOH,将使冷冻保护剂溶液对牙鲆胚胎的低温保护效果显著提高.对斑马鱼(Danio rerio)胚胎进行了较长时期的冷冻保存探索.在斑马鱼胚胎的冷冻保存研究中,还对解冻后胚胎的整体结构、组织学结构和超微结构的保存情况进行了观察分析.结果显示,保存效果好的解冻胚胎在整体结构上甚至看不出任何异常.而保存效果差的解冻胚胎则出现不同程度的结构异常,包括卵壳膜破裂脱落、胚胎膨胀(腹部变粗、体节肿胀并由原来的斜向后方的排列变为接近横向排列)、卵黄囊收缩或破裂、胚体断裂、甚至整个胚胎崩溃碎裂.对准冻保存后的解冻胚胎中酯酶活性用荧光素二乙酸酯法进行了显示.结果显示,解冻胚胎中酯酶活性产物——游离并发出荧光的荧光素在荧光亮度上与正常阳性对照胚胎中的无显著差异,但用热水杀死的阴性对照胚胎中无荧光出现.解冻胚胎与正常阳性对照胚胎之间的显著差异是荧光出现了不同程度的扩散现象,扩散程度随胚胎损伤的严重程度而异,表明解冻胚胎的细胞膜结构的完整性受到不同程度的破坏.而在正常阳性对照胚胎中没有荧光的扩散现象发生,说明正常胚胎的细胞膜完整,荧光素或酯酶不能扩散到细胞外.在我们的结果中,多数解冻后结构完好的胚胎中荧光很少扩散,甚至几乎没有向外扩散,说明它们完好的形态结构并不是简单地象制作生物标本一样被固定了下来,而是细胞膜仍然保持着较好的功能.
鱼;精子;胚胎;冷冻;保存
中国海洋大学
博士
海洋生物学
张士璀
2004
中文
S961.2
117
2005-05-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）