壳聚糖酶OU01底物结合与催化机理研究
壳寡糖是具有多种生物学功能的生物活性物质，在医药卫生、食品、农业等方面都具有广泛的研究及应用。在壳寡糖的制备方法中，以壳聚糖酶为基础的酶降解法具有专一性强，酶切效率高，反应条件温和，环保等优点，正受到越来越多的关注。迄今为止，已经从细菌、植物组织里发现了多种壳聚糖酶，对壳聚糖酶的基本性质、水解方式等都开展了研究。目前，已有三种壳聚糖酶单体的结构得到解析，为壳聚糖酶的研究提供了结构基础，但壳聚糖酶对底物的降解机制仍然不清楚。为此，本论文通过培养酶与底物复合物晶体，解析复合物的三维结构，从分子水平上对壳聚糖酶与底物的结合机理进行深入研究。本研究选取了酶活性较高的chitosanase OU01为研究对象，主要进行了以下几个方面的工作: 1、从菌株Microbacterium sp.的基因组中克隆了不含信号肽的chitosanase OU01基因。将基因与pGEX-6p-1相连，转化到E.coli BL21(DE3)中，构建了chitosanaseOU01的原核表达系统。通过IPTG诱导成功表达了重组蛋白。通过亲和层析、柱上酶切和凝胶过滤层析对重组蛋白进行了分离纯化，最终获得高纯度的chitosanase OU01，电泳结果显示其分子量在30 kDa左右。 2、利用TLC，质谱，NMR技术对chitosanase OU01的动力学参数、酶解产物、水解动力学进行了研究。基本动力学参数如下:Km为4.197 mg/ml，最大反应速率Vmax为0.049μmol/min，催化常数Kcat为12，297 min-1，比活力为476.6U/mg.protein;对脱乙酰度大于90％(DDA＞90％)壳聚糖进行充分水解后得到的产物主要为壳二糖和壳三糖;水解脱乙酰度大于99％(DDA＞99％)壳聚糖的整体水解过程表现出先快后慢的非均一性动力学过程。 3、参考序列比对，利用定点突变技术将两个氨基酸（Glu25与Asp43）分别突变成Ala，获得无催化活性的突变体，用于与壳六糖底物共混，进行复合物结晶。经过晶体生长条件的筛选与优化，获得了可用于X-射线衍射数据收集的复合物晶体。在此基础上，对复合物晶体结构进行了解析，首次获得了壳聚糖酶与底物的复合物晶体结构(PDBID:4OLT;4QWP)。 4、复合物结构的解析，进一步从结构角度确定了chitosanase OU01采用的是“inverting”催化机理，并首次阐明了催化关键氨基酸在催化反应中的作用。 5、通过复合物结构，首次揭示了chitosanase OU01结合口袋内部与每一个糖单元的相互作用。通过定点突变，进一步验证了chitosanase OU01结合口袋内部对底物结合起重要作用的氨基酸。 6、综合复合物结构、产物结构和分子对接分析，确定了-2位是chitosanase OU01中的底物特异性识别位点，该位点只能结合氨基葡萄糖，属于D-X-X（（-2）-(-1)-(+1))型底物特异性水解酶，该研究对chitosanase水解底物的特异性进行了重新定义。 7、通过表面电荷分析与突变体活性验证，寻找到了结合口袋之外对长链壳聚糖底物的结合起重要作用的氨基酸Asp40。 8、依据关键氨基酸残基对不同底物活性的影响及空间结构，对参与底物结合的关键氨基酸进行了分类，在此基础上，阐明了两类底物（寡糖底物和长链底物）与酶的复合物形成机理，并首次提出了长链底物与壳聚糖酶的“三步”结合原理。 9、通过复合物与文献报道的壳聚糖酶单体的结构比较，明确了“非连续”型壳聚糖酶在结构上的两个重要特征，一是结合口袋在水解过程中按照“开放-关闭-开放”的形式进行构象变化;二是参与底物结合的位点多为极性氨基酸，因此，酶与底物之间形成的相互作用主要是专一的氢键和静电作用。 本研究主要通过酶与底物的复合物晶体结构的解析，结合定点突变等生化技术，对chitosanase OU01的催化机理、酶切位点特异性、酶与底物复合物形成机理、“非连续”型壳聚糖酶结构特点等进行了研究，为壳聚糖酶的开发及应用提供了理论基础。
壳聚糖酶;底物复合物晶体;催化机理;三维结构
中国海洋大学
博士
生物化学与分子生物学
刘万顺;刘伟治
2015
中文
Q556
132
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）