几种海洋经济动物种质资源超低温冷冻保存研究
种质资源是海水养殖生产、优良品种培育及海洋渔业可持续发展的重要物质基础。然而，随着海水养殖业的快速发展，海洋动物核心种质鉴定和保护研究严重滞后的负面效应日益突出。超低温保存技术是种质细胞长期保存的重要方法，相关理论与技术的发展，对于种质资源的保护、遗传改良以及养殖业的可持续发展有着重要应用价值和理论意义。 1.太平洋鳕精液超低温冷冻 采用分步降温法冷冻保存太平洋鳕(Gadus macrocephalus)精液，并用扫描电镜和透射电镜技术研究了精子的超微结构损伤。分析了添加剂（蛋黄）及五种抗冻剂（PG（丙二醇）、DMSO(二甲基亚砜)、EG(乙二醇)、GLY(甘油)、MeOH(甲醇)）不同浓度(8％、10％、12％、14％、16％、18％)对太平洋鳕精子冷冻保存效果的影响。实验结果表明，蛋黄能够显著提高太平洋鳕冷冻保存效果(P＜0.05);在以HBSS为稀释液，12％PG中添加10％蛋黄保存的冻融精子运动率最高（85.87％±1.6％），显著高于其他冻存组(P＜0.05)。添加蛋黄的12％浓度的DMSO组解冻后精子运动速率较高，平均直线速度、平均曲线速度、平均路径速度分别达到了(120.39±20.78)μm/s、(120.39±20.78)μm/s、(155.64±12.02)μm/s，与其他各实验组差异显著(P＜0.05)。通过扫描电镜和透射电镜观察新鲜和冻融后的鳕鱼精子发现，鲜精中75.5％精子形态结构正常、24.5％精子形态结构异常;运动率最高的冻精中67％精子形态结构正常、33％精子形态结构异常。超低温保存对太平洋鳕精子结构产生了显著影响，细胞膜破裂、线粒体肿胀变形，鞭毛脱落、断裂。 2.条纹锯鮨精液超低温冷冻保存研究 为建立条纹锯鮨（Centropristis striata）精液超低温冷冻保存方法，实验采用计算机辅助精子分析系统(CASA)分析了六种抗冻保护剂(GLY[甘油]、DMSO[二甲基亚砜]、PG[丙二醇]、EG[乙二醇]、MeOH[甲醇]、DMA[二甲基乙酰胺]）在四种不同浓度下(5、10、15、20％，v/v)对条纹锯鮨精液冷冻保存的效果。结果显示:以HBSS为稀释液，采用程序降温仪分步降温冷冻保存条纹锯能精液，37℃水浴解冻后的精子中，15％PG作为抗冻保护剂的精子运动率最高，达到93.1±0.9％，与鲜精差异不显著(P＞0.05)，15％PG作为抗冻保护剂的精子水浴解冻后精子的运动速度最高，平均直线速度、平均曲线速度、平均路径速度分别达到了(88.3±0.3)μm/s、(76.2±0.5)μm/s、(86.7±0.7)μm/s，与鲜精差异不显著(P＞0.05)。在不同种类及不同浓度抗冻保护剂保护下，15％PG作为抗冻保护剂的精子解冻后1min内运动率变化与鲜精差异不显著(P＞0.05)。研究表明，15％PG为条纹锯鮨最佳抗冻保护剂，可用于条纹锯鮨精液的超低温冷冻保存。 3.太平洋牡蛎精液的超低温保存研究 本研究筛选了六种抗冻保护剂(GLY[甘油]，DMSO[二甲基亚砜]，PG[丙二醇]，EG[乙二醇]，DMA[二甲基乙酰胺]，MeOH[甲醇])及其五种不同浓度(6％，8％，10％，12％，14％，V/V)、三种稀释液（无钙HBSS，人工海水[ASW]，过滤海水[FSW]）、四种稀释比例(1∶1，1∶2，1∶4，1∶6)、三种添加剂（蔗糖，葡萄糖，海藻糖）、三个分步降温程序（程序A，程序B，程序C）对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)精液冷冻保存的影响，成功建立了太平洋牡蛎精液超低温保存方法:以10％ DMSO为抗冻保护剂，无钙HBSS为稀释液，1∶4的稀释比例，添加0.45mol/L的海藻糖，采用分布降温法冷冻保存太平洋牡蛎的精液，37℃水浴解冻后精液运动率达到71.27％±3.24％，显著高于其它实验组(P＜0.05)，受精率和孵化率分别达到95.04％±1.99％、93.33％±1.33％，与鲜精(88.89％±15.16％，94.90％±0.95％)、程序冷冻前精液(95.96％±2.15％，92.67％±14.83％)差异不显著(P＞0.05)，证明该太平洋牡蛎精液超低温保存方法可以应用于生产实践和科学研究中。 4.太平洋牡蛎精子超低温冷冻后超微结构损伤研究 采用程序降温仪分步降温冷冻保存太平洋牡蛎精液，并用扫描电镜、透射电镜研究了精子的超微结构损伤。超低温冷冻保存后太平洋牡蛎精子的运动率、受精率及孵化率与鲜精无显著差异。鲜精中84.5％的精子形态结构正常，冻精中73％的精子形态结构正常。形态结构正常的精子表现为顶体、质膜、线粒体与鞭毛结构完整、染色质形状规则，项体、线粒体及中心粒结构正常，鞭毛形态完整、微管结构清晰;形态结构异常的精子表现为顶体脱落、解体，精子头部质膜膨胀、破裂、染色质肿胀、破裂、解体，线粒体移位、脱落、膨胀，嵴退化或消失，鞭毛弯折、断裂，微管解聚。结果显示，以10％ DMSO为抗冻保护剂，HBSS溶液为稀释液，1∶4的稀释比例，添加海藻糖，采用分步降温法冷冻保存，对太平洋牡蛎精子具有较好的抗冻保护作用，合适的冻存方法可以有效的保护太平洋牡蛎精子冷冻过程中结构损伤。本研究将有助于太平洋牡蛎种质资源的收集保存及应用。 5.太平洋牡蛎担轮幼虫的超低温保存研究 本实验研究了六种抗冻保护剂GLY(甘油)、DMSO(二甲基亚砜)、PG(丙二醇)、EG(乙二醇)、DMA(二甲基乙酰胺）和MET(甲醇)在三种不同浓度下(5％、10％、15％，v/v)对太平洋牡蛎担轮幼虫的毒性作用及冷冻保存的影响。太平洋牡蛎担轮幼虫毒性实验证明:抗冻保护剂的种类和浓度对太平洋牡蛎担轮幼虫产生的毒性强弱不同，在抗冻保护剂浓度为5％时，GLY、DMSO、PG、EG对太平洋牡蛎的毒性作用显著低于其他抗冻保护剂(P＜0.05);随着抗冻保护剂浓度增加到10％，GLY、DMSO、EG、MET对太平洋牡蛎担轮幼虫的毒性作用显著低于其他抗冻保护剂(P＜0.05);而抗冻保护剂浓度为15％时，GLY、DMSO对太平洋牡蛎担轮幼虫的毒性作用显著低于其他抗冻保护剂(P＜0.05)，且随着抗冻保护剂浓度的升高，其对太平洋牡蛎担轮幼虫的毒性作用也增大。太平洋牡蛎担轮幼虫的超低温冷冻保存实验证明:以10％ DMSO作为抗冻保护剂，采用分步降温法冷冻保存太平洋牡蛎担轮幼虫，28℃水浴解冻后担轮幼虫运动率达到(73.00±2.00)％，显著高于其他实验组(P＜0.05)，其次为GLY组，且各浓度间差异不显著(P＞0.05)。该研究为太平洋牡蛎及其他贝类胚胎保存提供了科学依据，在贝类遗传育种和生物技术等方面具有一定的应用前景，具有重要的生产实践价值。
海洋经济动物;种质资源;超低温冷冻保存技术
中国海洋大学
硕士
水生生物学
温海深;李军
2015
中文
S931.5
99
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）