溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)SR1热修饰性外膜蛋白30kDa的筛选鉴定及其对牙鲆的免疫保护力研究
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是海水养殖动物如鱼、虾、贝类等的致病菌可引起多种海水养殖动物及人类发病,研制相关疫苗,开展免疫防治是预防该类疾病的重要手段。目前研究表明,热修饰性蛋白(Heat-modifiable protein)是一类保守性较高,免疫原性良好的细菌外膜蛋白,是一种潜在的细菌病疫苗候选材料,所以本研究以此为切入点,对溶藻弧菌热修饰性蛋白进行筛选鉴定。根据热修饰性蛋白在不同温度下具有不同电泳迁移性的特性,本论文对提纯的一株大菱鲆致病性溶藻弧菌SR1的外膜蛋白进行热处理,并结合电泳及免疫学手段,筛选、鉴定出了溶藻弧菌外膜蛋白中的一个分子量为30kDa的具热修饰特征的蛋白,比较分析其抗原保守性及在各溶藻弧菌内的分布情况,进而以双向电泳结合质谱鉴定技术对30kDa的蛋白种类进行了鉴定,并对牙鲆进行免疫与攻毒,验证了热修饰性外膜蛋白30 kDa的免疫保护力。具体方法结果如下: (1)用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)抽提并结合超速离心的方法提取了一株大菱鲆致病性溶藻弧菌SR1的主要外膜蛋白。将外膜蛋白样品与等体积电泳上样缓冲液混合,分别经28℃、37℃、50℃、60℃、70℃、100℃处理5 min后行SDS-PAGE,发现样品经28℃处理,30 kDa蛋白为外膜蛋白的主要高丰度蛋白,当样品经100℃处理,30 kDa蛋白丰度显著降低,同时出现36 kDa和37.5kDa两条明显的蛋白条带。28℃处理样品经电泳切胶洗脱得到30 kDa纯化蛋白,分别经28℃、100℃处理后行SDS-PAGE发现只有极少量蛋白呈现为30 kDa,大部分呈现为36 kDa和37.5 kDa。将该蛋白样品作为抗原免疫大鼠制备抗血清,Western blotting分析上述梯度温度处理的SR1外膜蛋白。结果显示,抗血清与经各梯度温度处理的样品中的30kDa蛋白均发生免疫印迹反应,还与50℃处理样品中的37.5 kDa蛋白及60℃、70℃、100℃处理样品中的36 kDa和37.5 kDa蛋白发生免疫印迹反应,表明了30 kDa外膜蛋白具有经加热处理后转化为36kDa和37,5 kDa蛋白的热修饰特性,是一种热修饰性蛋白。 (2)对SR1等5株溶藻弧菌及副溶血弧菌、哈维氏弧菌等其他6种弧菌外膜蛋白分别经28℃、100℃处理5 min后的SDS-PAGE分析发现,溶藻弧菌各菌株的30 kDa外膜蛋白和副溶血弧菌的29.5 kDa外膜蛋白具有热修饰性。Westernblotting分析显示,抗血清可与28℃处理的溶藻弧菌各菌株的30 kDa外膜蛋白和副溶血弧菌菌株的29.5 kDa外膜蛋白发生免疫印迹反应,还与100℃处理的溶藻弧菌各菌株的30 kDa、36 kDa(以及其中SR1的37.5 kDa)和副溶血弧菌菌株的29.5 kDa、35 kDa外膜蛋白发生免疫印迹反应,与其他5种弧菌的外膜蛋白不发生印迹反应。间接ELISA法检测结果显示鼠抗血清与溶藻弧菌SR1、283、284、RB、RH2及副溶血弧菌458的外膜蛋白反应均为阳性,P/N值分别为6.8、4.9、3.4、4.1、6.5、2.3,与其他5种弧菌的外膜蛋白反应均为阴性(P/N<2.1)。结果初步证实了溶藻弧菌SRl的30 kDa外膜蛋白在溶藻弧菌种内具有较高的抗原保守性。 (3)以Sarkosyl法分别提取了溶藻弧菌283、284、RB、RH2的外膜蛋白,对其分别经28℃、50℃、70℃、100℃温度处理5 min后行SDS-PAGE,发现4株菌株的外膜蛋白均呈现出了与SR1外膜蛋白相似的热迁移性,经28℃、50℃处理后有一条高丰度蛋白存在于30 kDa分子量处,而经70℃、100℃处理此蛋白丰度降低为一条低丰度蛋白,在图中几乎无法辨识,同时在更高分子量位置有几条新蛋白条带出现。Western blotting结果显示鼠抗血清可与28℃处理的溶藻弧菌各菌株的30 kDa外膜蛋白发生免疫印迹反应,还与100℃处理的各菌株的30 kDa、36 kDa外膜蛋白发生免疫印迹反应,表明溶藻弧菌283、284、RB、RH2的30 kDa外膜蛋白具有热修饰性,与SR1的30 kDa蛋白相同,也是热修饰性蛋白。胰蛋白酶消化试验结果显示,溶藻弧菌各菌株的外膜蛋白经消化后36 kDa蛋白消失,同时相对于未消化处理多出一条新蛋白条带,分子量分别为19.5 kDa、18 kDa、18 kDa、18.5 kDa、19.5 kDa。最后,为了对各菌株的热修饰性蛋白30 kDa进行细胞表面定位,以各菌株的活菌菌体作为吸附剂对菌株SR1的热修饰性蛋白30 kDa抗血清进行吸附试验,结果证实了各菌株的30UDa均暴露于细菌表面。该结果为接下来的免疫保护力分析试验提供了理论依据。 (4)热修饰性蛋白30 kDa对牙鲆的免疫保护力研究结果表明,免疫后第4周末以3株溶藻弧菌SR1、284、RH2对牙鲆攻毒感染后,免疫组呈现出显著高于未免疫组的成活率。以间接ELISA法测定了免疫后6周的抗血清效价变化,发现抗体效价缓慢升高并在第4周达到最高值,随后几周逐渐下降。 (5)最后,以双向电泳技术对纯化的SR1的热修饰性蛋白的30 kDa的蛋白质点组成进行分析,结果显示30 kDa蛋白含有3个蛋白质点,等电点(pI)相同,均偏酸性(pH～4.66),其中一质点保持于30 kDa位置处,另外两个质点迁移至37.5 kDa、36 kDa处,经质谱鉴定均显示为OmpA。肽聚糖结合试验证实3个蛋白质点均不与肽聚糖结合或结合不紧密,胰蛋白酶消化结果显示,36 kDa蛋白被消化成一分子量为19.5 kDa的小分子多肽,而30 kDa和37.5 kDa蛋白可抵御消化,保持于原来的分子量处。热敏性研究结果显示随着处理温度的升高及时间的延长,30 kDa和36 k Da,蛋白的丰度和位置始终保持不变,而37.5 kDa蛋白经28℃、60℃、100℃处理5 min后丰度与位置保持不变,而随着在100℃加热时间的延长蛋白丰度逐渐降低,同时有2条分子量分别为22 kDa、15 kDa的低分子量蛋白条带出现,且蛋白丰度逐渐升高。由以上结果表明溶藻弧菌SRl的热修饰性外膜蛋白30 kDa,是OmpA,且存在有3种特性不同的构象异构体。
溶藻弧菌;热修饰性外膜蛋白;筛选鉴定;免疫保护力
中国海洋大学
硕士
水产养殖
周丽;战文斌
2012
中文
S944.121
77
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）