当归多糖对点带石斑鱼非特异性免疫力的影响
当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide,ASP)对哺乳动物具有免疫调节作用,但对水产动物是否具有免疫调节作用尚未见报道。本文首先从中草药当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels中提纯当归多糖,并对当归多糖亚组分进行结构分析。然后通过喂食、腹腔注射和体外试验研究当归多糖对点带石斑鱼(EpinePhelus malabaricus)非特异性免疫力的影响,为当归多糖在水产养殖上的应用提供理论依据。 本论文主要研究内容和结论概况如下。用水煮醇沉法从中草药当归中提取当归粗多糖,乙醇、丙酮脱色、Sevag法除蛋白质,透析、冻干得当归多糖P0。将当归多糖P0溶液用DE-52纤维素柱层析,依次用蒸馏水、0.1M NaCl、0.2MNaCl、0.4M NaCl洗脱得当归多糖P1、P2、P3和P4四种亚组分。采用高效液相色谱、红外光谱和甲基化法研究当归多糖P1、P2、P3分子量和结构。结果表明:当归多糖P1、P2、P3和P4中蛋白质分别为2.21％、1.38％、2.53％和2.34％,总糖分别为95.10％、94.73％、81.68％和79.51％,还原糖分别为5.75％、4.85％、4.86％和4.77％。当归多糖P1、P2、P3分子量分别为4.12x105Da,2.34～105Da和1.94～105 Da。当归多糖P1、P2、P3的单糖组成分别为Glc:Xyl:Gal=18:3:1,GlcA:Glc:Xyl:Gal:7:8:3:2和Glc:Xyl=28:1。当归多糖P1、P2、P3的单糖残基均为β构型的吡喃环。当归多糖P1中Glcp为1→3,6、1→3和1→连接,Xylp和Galp为1→3连接;当归多糖P2中GlcAp为1→3连接,Glcp为1→3,6、1→3和1→连接,Xylp和Galp为1→3连接;当归多糖P3中Glcp为1→6、1→4、1→3,6、1→3和1→连接,Xylp为1→3连接。 为研究当归多糖对点带石斑鱼非特异性免疫力和抗病力的影响,将当归多糖P0按0、500、3000 mg/kg添加到饲料中,喂食点带石斑鱼4、8、12周后取样。结果表明:当归多糖P0能显著提高点带石斑鱼血液白细胞吞噬能力,血清溶菌酶(LZM)活力,头肾白细胞呼吸爆发活力、增殖活力和吞噬能力,降低Edwardsiella tarda攻毒后点带石斑鱼的累积死亡率。用3000 mg/kg的当归多糖PO连续喂食12周,点带石斑鱼非特异性免疫力和抗病力最高。 将当归多糖P0按0、500、3000 mg/kg添加到饲料中,连续喂食101 d,研究当归多糖P0对点带石斑鱼生长和非特异性免疫力的影响。结果表明:当归多糖P0对点带石斑鱼摄食、生长、体表黏液抗菌活力、血清一氧化氮(NO)、总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白(A/G)值影响不显著(p＞0.05);低剂量的当归多糖P0能显著提高体表黏液LZM活力,而高剂量的当归多糖P0能显著提高血液白细胞数、NBT阳性细胞数,并能提高血液白细胞吞噬率和血清LZM活力;当归多糖P0能极显著降低点带石斑鱼E. Tarda攻毒后的累积死亡率,500、3000 mg/kg组的免疫保护率分别为45％、69％。 为研究当归多糖亚组分对点带石斑鱼非特异性免疫力的影响,将当归多糖P1、P2、P3按20 mg/kg体重的剂量腹腔点带石斑鱼,以当归多糖P0做对照,以无菌PBS做空白,在注射前和注射后第3、7、14、21、28 d取样。结果发现:当归多糖P0及其亚组分能显著提高点带石斑鱼体表黏液LZM活力、血液白细胞数和NBT阳性细胞数、血清LZM活力、NO含量和A/G值。当归多糖P0能显著提高点带石斑鱼体表黏液抗菌活力,而各多糖亚组分对黏液抗菌活力影响不显著。当归多糖P0及其亚组分对点带石斑鱼非特异性免疫力具有时间一效应关系:注射当归多糖免疫指标升高,注射后28 d恢复到空白组水平。注射当归多糖P0及其亚组分均能降低E. Tarda攻毒后点带石斑鱼的死亡率,注射当归多糖P0组死亡率最低。单独注射当归多糖各亚组分对点带石斑鱼非特异性免疫力的提高不及当归多糖P0。 为研究当归多糖亚组分对头肾白细胞免疫活性的影响,用不同浓度(0、1、10、100、1000μg/mL)的当归多糖亚组分P1、P2、P3体外孵育点带石斑鱼头肾白细胞,以当归多耱P0做对照,测定当归多糖对白细胞增殖、呼吸爆发和吞噬能力的影响。结果表明:当归多糖P0及其亚组分体外能提高点带石斑鱼头肾白细胞增殖、吞噬和呼吸爆发活力。头肾白细胞增殖和呼吸爆发活力随当归多糖P0及其亚组分剂量的增加而增强。当归多糖P0(1000μg/mL)对增殖影响显著。当归多糖P2(1-1000μg/mL)对呼吸爆发活力影响显著。头肾白细胞吞噬能力随当归多糖P0及其亚组分剂量的增加呈显著的先升高后下降的趋势。当归多糖P、P1为100μg/mL时吞噬能力最高,当归多糖P2和P3在10μg/mL时吞噬能力最高。 总之,当归多糖P0及其亚组分P1、P2、P3通过提高体液和细胞免疫的方式提高点带石斑鱼非特异性免疫力和抗病力。各亚组分单独作用时对点带石斑鱼非特异性免疫力的提高不及当归多糖P0。当归多糖亚组分在结构和分子量上的差异可能是造成其免疫活性不同的原因。β吡喃环单糖残基是当归多糖具有生物学活性的基础。
当归多糖;点带石斑鱼;非特异性免疫力;抗病力;水煮醇沉法
中国海洋大学
博士
水生生物学
马甡;邢克智
2012
中文
S948
139
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）