牙鲆免疫应答的温度效应及黏膜免疫分子的研究
近二十年来，随着分子生物学和免疫学技术的发展，渔用疫苗的研发进入了快速发展的阶段，给养殖鱼类疾病免疫防治带来了希望。由于免疫防治的效果受到多种因素的影响和控制，所以要达到理想的病害免疫防治效果，需要考虑鱼体自身免疫系统组成特点及免疫应答规律。鱼类黏膜免疫系统是鱼类抵抗病原入侵的第一道防线，而免疫应答受环境因素尤其温度的影响非常显著，因此，深入研究温度对鱼类免疫应答的影响规律及鱼类黏膜免疫分子特性、功能是开展鱼类病害免疫防治的前提和基础。
本论文在国家自然科学基金项目资助下完成，分析了不同温度下牙鲆系统及黏液免疫应答的水平变化；纯化分析了牙鲆皮肤黏液免疫球蛋白(Ig)，并制备了其单克隆抗体，应用该抗体研究了牙鲆黏液Ig与血清Ig、表面抗体阳性细胞的关系；另外克隆了牙鲆多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因cDNA全序列，RT-PCR分析该基因在不同组织内的差异表达情况，并对其进行体外表达，研究了重组蛋白的特性；同时研制出牙鲆pIgR多克隆抗体，并利用该多抗鉴定了皮肤黏液中的受体蛋白，为探讨pIgR的特性及功能奠定了基础。具体研究内容和结果如下：
(1)牙鲆免疫应答的温度效应研究。应用流式细胞术及间接酶联免疫吸附(ELISA)研究了不同水温(9℃、15℃、21℃和26℃)下用灭活LCDV疫苗腹腔注射牙鲆后的系统免疫应答变化，结果表明，外周血、脾及前肾组织中表面抗体阳性(SmIg+)细胞比例及血清中抗体水平在21℃下变化最大，低温(9℃和15℃)时变化缓慢，且峰值水平较低；26℃下峰值低于21℃温度时峰值。同时应用ELISA检测了皮肤黏液中特异性抗体水平的变化，分析了温度对牙鲆皮肤黏液抗体产生的影响。结果表明，皮肤黏液中特异性抗体水平在21℃水温下OD值上升最快，且达峰值时间最早；低温(9℃和15℃)时变化缓慢，且峰值水平较低。以上结果说明牙鲆免疫应答与温度密切相关，在最适温度21℃时变化最大，低温或高温时免疫应答受抑制。
(2)黏液Ig的分离纯化。采用饱和硫酸铵分步盐析牙鲆黏液后，应用AKTA prime蛋白质纯化系统，通过凝胶柱Sephacryl S-300、HiTrap DEAE Sepharose Fast FlowColumn两种预装层析柱纯化牙鲆黏液Ig，并进行了分子量的初步测定。结果表明，饱和硫酸铵分步盐析、Sephacryl S-300和DEAE Sepharose Fast Flow Column三种方法结合可特异性的分离牙鲆黏液Ig，纯度高，变性电泳SDS-PAGE检测分析得出纯化获得牙鲆黏液Ig的重链和轻链分子量分别为72 kDa和26 kDa，非变性电泳Native-PAGE结果显示纯化的牙鲆黏液Ig分子量为798 kDa。
(3)抗牙鲆黏液Ig单克隆抗体的制备及应用。以纯化的牙鲆黏液Ig为抗原免疫Balb/C小鼠，采用单克隆抗体技术获得了8株抗牙鲆黏液Ig的单克隆抗体(1A-M2、1C-M10、1E-M2、1F-M7、3F-M9、3G-M5、8B-M4、BE-MS)。Western blotting结果显示：8株单抗识别的抗原决定簇均位于牙鲆黏液Ig的重链(72kDa)上。应用抗牙鲆黏液Ig单抗(1A-M2)及之前实验室制备的抗血清Ig单抗2D8，通过流式细胞术同时分析了牙鲆各组织中的SmIg+细胞的比例，1A-M2孵育结果分别为外周血细胞(38.64％)，脾(23.6％)，皮肤(16.56％)和鳃(6.26％)，2D8孵育结果分别为外周血细胞(48.89％)，脾(33.7％)，皮肤(15％)和鳃(6.02％)，说明抗牙鲆黏液Ig单抗及抗血清Ig单抗均可与SmIg+细胞反应，黏液Ig与血清Ig至少具有部分抗原相似性：另外应用制备的1A-M2及抗血清Ig单抗2D8通过Western blotting分析牙鲆黏液Ig及血清Ig抗原性差异，结果表明1A-M2只与黏液Ig反应，不与血清Ig反应，而单抗2D8可与黏液Ig与血清Ig反应，说明黏液Ig与血清Ig存在抗原性差异。
(4)牙鲆pIgR基因cDNA序列的克隆、表达及特性分析。通过RACE技术获得pIgR cDNA序列，全长1384 bp，含一个1005 bp的开放阅读框(ORF)，编码335氨基酸，蛋白分子量大小为37.6 kDa。同时，利用半定量RT-PCR分析了pIgR基因在牙鲆不同组织内的转录差异情况，结果显示该基因在肠、肝脏、鳃和皮肤中表达量最高，脾和前肾次之，在胃和肌肉中转录水平最低，说明该基因与牙鲆黏液Ig转运密切相关。同时成功地构建了表达牙鲆pIgR ORF的重组质粒，诱导表达后，得到包涵体形式的pIgR重组蛋白(rpIgR)，分子量为58 kDa。ELISA实验结果说明rpIgR具有与牙鲆Ig结合的活性。另外制备了鼠抗牙鲆rpIgR抗血清，Western blotting结果显示，鼠抗牙鲆pIgR抗血清可与rpIgR发生特异性结合，同时能特异性识别1条分子量为37 kDa左右牙鲆皮肤黏液蛋白，推测其为牙鲆自然状态下的pIgR。本研究为探讨pIgR的特性及功能奠定了基础。
牙鲆;免疫球蛋白;多聚免疫球蛋白受体;免疫应答;温度效应;黏膜免疫分子
中国海洋大学
博士
水产养殖
战文斌;绳秀珍
2012
中文
S941
109
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）