菲律宾蛤仔(Venerupis philippinarum)在苯并(a)芘胁迫下差异基因的筛选与分子生物标志物的研究
本文根据目前我国近海多环芳烃污染现状，以近海养殖重要经济贝类菲律宾蛤仔(Venerupis philippinarum)为研究对象，克隆了菲律宾蛤仔芳烃受体介导的解毒代谢途径几种关键基因，包括芳烃受体蛋白(AhR)、芳烃受体核转位因子(ARNT)、热休克蛋白90(HSP90)。研究了毒性强的多环芳烃(PAHs)-最苯并(a)芘(BaP)对菲律宾蛤仔组织解毒代谢相关基因的表达调控规律，通过对在BaP胁迫下菲律宾蛤仔解毒代谢相关基因的克隆及基因表达分析，探究双壳贝类PAHs解毒代谢机制；构建了菲律宾蛤仔PAHs消减cDNA文库，筛选、鉴定了差异表达基因，结合室内实验和海区现场验证，初步建立了基于菲律宾蛤仔的PAHs分子生物标志物监测技术，为海洋环境污染监测和水产品安全评价提供基础数据和技术支持。
1菲律宾蛤仔芳烃受体(AhR)介导的关键基因克隆与表达分析
菲律宾蛤仔芳烃受体蛋白(VpAhR)的cDNA全序列长2870 bp，开放阅读框(ORF)长为2391 bp，共编码796个氨基酸残基，不具备信号肽，属于胞内蛋白，含有2个核定位序列(NLS)：K45RRRR49和p67SKRHRE73。BLAST分析表明VpAhR与其它物种AhR基因具有较高的同源性。VpAhR含有1个碱性螺旋-环-螺旋结构(bHLH domain)和2个配体结合区(PAS domain)，属于bHLH-PAS转录因子家族。序列分析显示，VpAhR的配体结合区(a.a.220-383)与砂海螂(M.arenaria)和斑马纹贻贝(D.polymorpha)AhR的配体结合区相似性很高。实时定量PCR分析表明VpAhR在菲律宾蛤仔的鳃、消化盲囊、外套膜和闭壳肌中均有表达，鳃组织中表达量最高。
菲律宾蛤仔ARNT片段长485 bp，编码161个氨基酸残基，该序列含一个由44个氨基酸构成的PAS结构域(a.a.7-50)，该区域与其他物种ARNT的PAS结构域相似性较高；VpARNT在菲律宾蛤仔消化盲囊中表达最高，在鳃、外套膜和闭壳肌中也均有分布。HSP90是分子伴侣家族的重要一员，菲律宾蛤仔的HSP90基因片段cDNA长687 bp，编码299个氨基酸，具有HSP90家族保守信号区(GVVDSEDLPLNISRE)，与其他物种HSP90氨基酸序列具有很高相似性，与栉孔扇贝(C.farreri)和海湾扇贝(A.irradians)的相似性均为99％，菲律宾蛤仔HSP90在鳃组织中表达量最高；不同浓度BaP(0.01、0.2μg)染毒处理3d、10 d，菲律宾蛤仔鳃组织中AhR、ARNT、HSP90和GSTpi的基因表达水平随染毒浓度增大和处理时间延长而逐渐升高；除10 d时0.2μg/L组CYP4基因表达被极显著(P<0.01)上调外，其余处理组CYP4 mRNA表达水平在染毒期间与对照组差异不显著(P>0.05)。实验结果表明BaP与AhR介导的菲律宾蛤仔解毒代谢相关基因AhR、ARNT、HSP90和GSTpi的mRNA表达具有明显的剂量-效应关系，符合生物标志物筛选原则，适于进行进一步的分析和现场验证。
2菲律宾蛤仔在苯并(a)芘胁迫下cDNA消减文库的构建与分析
利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了BaP胁迫下(1μg/L)菲律宾蛤仔正、反向cDNA消减文库，分别获得194个和93个重组克隆，测序分析显示，正、反向文库分别得到168个和83个EST序列，经同源序列相似性比对，正向cDNA文库中有31种基因与已知功能基因具有较高同源性，12种为假定蛋白，2种为未知蛋白；反向文库中已知功能基因10种，假定蛋白4种。所有ESTs序列信息均已提交Genbank数据库，cDNA消减文库编号为LIBEST_027169。进一步序列比对、功能注释及分类显示，通过SSH筛选到的菲律宾蛤仔差异表达基因主要为药物代谢、杂环化合物代谢、细胞分解代谢、抗生素响应等代谢过程相关基因。
3菲律宾蛤仔在苯并(a)芘胁迫下分子生物标志物的筛选与验证
设置一系列BaP染毒浓度(0.25、1和4μg/L)，利用实时定量PCR检测染毒处理10 d时菲律宾蛤仔解毒代谢相关基因、SSH-selected差异表达基因及几种其他功能基因的mRNA表达。结果显示，测定的28种基因中Defensin、Serine protease、Thioesterprotein、GST C、Mn-SOD、ARNT等12种基因被BaP诱导表达上调，与染毒浓度呈线性正相关关系，因此适于作为潜在的分子生物标志物进行进一步研究与验证。
在胶州湾和胶南附近海域各选择一个实验站点(S1和S2)，于2011年12月采集各站点表层海水及菲律宾蛤仔样品。高效液相色谱法(HPLC)测定海水中PAHs含量和菲律宾蛤仔软体部中PAHs的累积量。结果显示，S1站点海水和菲律宾蛤仔组织中的总PAHs和BaP含量均高于S2站点；实时定量PCR分析表明，除HSP90和AhR外，PAHs含量较高的S1站点的其余10种分子生物标志物基因表达水平明显高于S2站点，表现出一定的剂量-效应关系。由此表明，菲律宾蛤仔12种基因基本符合生物标志物筛选原则，适于作为分子生物标志物用于海洋环境PAHs污染监测及毒性效应评估。
菲律宾蛤仔;苯并(a)芘;基因克隆;抑制性消减杂交;分子生物标志物
中国海洋大学
博士
水产养殖
潘鲁青
2012
中文
X174
161
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）