高温胁迫下龙须菜抗氧化系统的研究
龙须菜((Gracilaria lemaneiformis)是一种重要的产琼胶海藻，在我国已成为继海带和紫菜后的第三大栽培海藻。随着龙须菜养殖业的不断发展，对龙须菜种质提出了更高的要求，研究者们先后选育出良种981和耐高温新材料07-2两个龙须菜新品系，使得龙须菜品质得到了不断改良，其耐高温性能也不断提高。但是目前关于不同品系龙须菜抗逆性差异的研究很少，关于龙须菜高温胁迫响应机理了解的也不清楚。本论文对影响龙须菜耐高温性能的重要因子-抗氧化系统进行研究，旨在了解龙须菜的高温胁迫响应机制，为培育抗逆性更强的龙须菜新品系提供理论依据。
首先，以野生型龙须菜、龙须菜良种981及耐高温新材料07-2三个品系为材料，研究在常温24℃和不同高温28℃和32℃条件下其总抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化物酶(POD)四种抗氧化酶的活性变化及非酶促抗氧化剂(维生素C、维生素E)的含量变化，另外还有可溶性蛋白和丙二醛(MDA)的含量变化。结果表明：高温胁迫下，981和07-2的总抗氧化能力均高于野生型；无论是酶促抗氧化系统还是非酶促抗氧化系统981和07-2都不同程度地优于野生型。可见，高温胁迫下981和07-2与野生型相比具有更强的清除活性氧的能力，表明抗氧化活性指标与龙须菜耐热性有相关性。
然后，根据实验室前期构建的龙须菜高温胁迫抑制性消减杂交文库(SSH)中获得的序列，运用RACE及巢式PCR等技术，克隆得到了龙须菜锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、谷胱甘肽还原酶(GR))、钒-溴过氧化物酶(V-BPO)和过氧化还原酶Ⅵ(PrxⅥ)五个抗氧化酶基因的cDNA全长序列和过氧化氢酶(CAT)的部分序列。结果如下：Mn-SOD的cDNA序列全长852bp，其中ORF长675bp，共编码224个氨基酸，5’UTR长度为109bp，3’UTR长度为68bp。GSH-PX的cDNA序列全长930bp，包括5’端UTR109bp，3’端UR71bp，其ORF长度为750bp，编码249个氨基酸。GR的cDNA序列全长为1572bp，其中包括5’UTR120bp，3’UTR36bp。其ORF长度为1416bp，共编码471个氨基酸。V-BPO的cDNA全长2372bp，其中ORF长1830bp，5’UTR长度为299bp，3’UTR长度为243bp，共编码609个氨基酸。PrxⅥ的cDNA序列全长987bp，其中ORF长为672bp，5’UTR长度为106bp，3’UTR长度为209bp，共编码223个氨基酸。以cDNA的ORF区两侧设计引物扩增其DNA序列，发现Mn-SOD、GSH-PX、GR、V-BPO和PrxⅥ五个基因的DNA序列均与其cDNA中的ORF序列一致，表明他们在基因组中都没有内含子结构，转录过程不需要mRNA的剪切，这可能与抗氧化系统在逆境胁迫下需快速响应有关。此外本实验克隆得到了905bp的龙须菜CAT部分cDNA序列，经分析该序列可编码301个氨基酸。
进一步比较发现，野生型和981龙须菜中Mn-SOD、GSH-PX、GR、V-BPO和PrxⅥ五种抗氧化酶基因序列无差异，通过基因组Southern杂交证明：Mn-SOD和V-BPO在野生型和981龙须菜中均为多拷贝，GSH-PX、GR和PrxⅥ在野生型和981龙须菜中都是以单拷贝形式存在的。
在克隆得到六种抗氧化酶cDNA序列的基础上，运用荧光定量PCR技术检测高温胁迫条件下(32℃)野生型龙须菜、981龙须菜及耐高温新材料07-2的六种抗氧化酶基因的表达水平，结果表明不同的抗氧化酶在三个龙须菜品系受高温胁迫时发挥的作用并不相同，其中GSH-PX和GR是981龙须菜在高温胁迫下起主要作用的抗氧化酶，其表达上调，而PrxⅥ和CAT则在高温胁迫下明显下调表达。07-2龙须菜中，PixⅥ和CAT在高温胁迫下表达上调，而GR的表达则在高温胁迫下明显下调，推测PrxⅥ和CAT是07-2龙须菜在高温胁迫下起主要作用的抗氧化酶；野生型龙须菜六种抗氧化酶的表达在32℃高温胁迫下均受到抑制，出现不同程度的下调。综合比较三个品系龙须菜抗氧化酶的总体表达水平：07-2最高，981次之，野生型最低，再一次验证了耐高温新材料07-2和良种981在耐高温性能上的优势。结合野生型和981龙须菜中抗氧化酶基因序列及基因拷贝数无差异的情况，推测抗氧化酶基因的序列与龙须菜的耐高温性能无直接相关性，其调控序列或者某些调控因子可能才是调控抗氧化酶表达，进而影响龙须菜耐高温性能的关键因素。
本文首次对高温胁迫下龙须菜抗氧化系统各组分活性进行测定并对抗氧化酶系统六个关键酶基因进行克隆与表达分析，为阐述龙须菜高温胁迫响应机制奠定基础，并为选育抗逆性更强的龙须菜品系提供可用的选择标签及序列信息。
高温胁迫;龙须菜;抗氧化系统;Southern杂交;荧光定量PCR
中国海洋大学
硕士
遗传学
臧晓南
2012
中文
S917.3
112
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）