龙须菜高温胁迫响应的钙调素信号传导途径的研究
龙须菜是一种重要的产琼胶海藻，研究龙须菜的高温胁迫分子响应机理对于提高其高温耐受性，延长栽培期，提高产量具有重要意义。研究表明，钙-钙调素(Ca2+-CaM)信号传导系统在植物的高温胁迫响应中起重要作用。本论文拟在前期通过对龙须菜进行高温胁迫下的SSH差异显示得到CaM的表达序列标签的基础上，首次克隆龙须菜的CaM基因及筛查到的其结合蛋白--肌醇-1-磷酸合成酶(MIPS)的基因，并研究其在高温胁迫下的表达模式，为探讨龙须菜对高温胁迫的响应机理打下基础，并为龙须菜耐高温品系的选育提供可用的基因信息。
本论文首先分别从野生型和981龙须菜中克隆得到多种钙调素(CaM)亚型基因。野生型龙须菜包含三种CaM亚型基因-cam1、cam2和cam3，981龙须菜包含两种CaM亚型基因-cam1和cam2。其中，cam1在两种龙须菜中完全一致，其cDNA序列长度均为526bp，ORF长450bp，可编码150个氨基酸，其DNA序列长度均为832bp，含有4个外显子，3个内含子，cam1在两种龙须菜的基因组中均为单拷贝。而cam2在两种龙须菜中有所不同，其中野生型龙须菜cam2 cDNA全长为600bp，ORF长447bp，可编码149个氨基酸，981龙须菜cam2cDNA全长为474bp，ORF长447bp，可编码149个氨基酸，两种cam2的DNA序列均无内含子，基因相似性为78％，其所编码的氨基酸序列的相似性为87％。cam3 DNA序列长度为809bp，预测其具有2个内含子，3个外显子，预测的cDNA序列长度为447bp，但目前该基因只能从野生型龙须菜基因组DNA中扩增得到，无法从cDNA中扩增得到，推测cam3可能在转录过程中沉默。
采用荧光定量PCR的方法测定在28℃和32℃的热激条件下，981和野生型龙须菜不同CaM亚型的表达情况，发现无论是在28℃还是32℃的热激条件下，cam1在981龙须菜中的表达水平在整体上高于野生型龙须菜，表明981龙须菜的cam1在高温胁迫下能更有效表达，以传递热激信号，使得981龙须菜对高温的耐受能力更强。cam2在981龙须菜中的表达情况与cam1不完全一致，在28℃热激时，cam2的整体表达水平低于cam1，但在32℃热激条件下，两者表达情况相似，推测在981龙须菜热胁迫信号的传导过程中，CaM1可能为起主要作用的CaM亚型，而CaM2只有在981龙须菜处于温度更高、热激时间更长等更为苛刻条件下时才会上调表达，对CaM1起到有效的补充和辅助作用。此外，本实验发现野生型龙须菜的cam2只有通过巢式PCR反应才能够从其高温胁迫表达的cDNA中扩增出来，而不能通过一步PCR反应直接扩增到目的条带，可能由于其在cDNA中的拷贝量较低，因此无法利用荧光定量PCR对其热胁迫下的表达水平进行检测。相比较而言，981龙须菜中可能有更多的CaM参与热激信号传导，这可能与981龙须菜耐高温性更强直接相关。
据文献报道CaM自身并没有活性，只有活化后进一步与钙调素结合蛋白(CaMBP)的短肽序列结合，才能诱发其结构变化，从而共同调控信号传导途径，因此研究CaMBPs有助于探明钙调素介导的信号转导途径。本实验室前期通过酵母双杂交系统筛查获得了龙须菜CaM结合蛋白--肌醇1-磷酸合成酶(myo-inosito1-1-phosphate synthase，MIPS)的EST，本论文在此基础上扩增得到mips的cDNA和DNA序列全长，该序列在981龙须菜和野生型龙须菜中完全一致，且与其它物种mips具有较高同源性，其DNA序列全长为2067bp，无内含子，开放阅读框为1623bp，可编码540个氨基酸。对MIPS氨基酸序列分析，推测其CaMBD(CaM_Binding Domain)为第212位至236位氨基酸，符合大多数CaMBD所具有的结构特征。将该MIPS与CaM进行酵母双杂交回复验证，证明MIPS与CaM存在相互作用，是龙须菜的一种钙调素结合蛋白。通过Real-TimePCR对32℃热激下981龙须菜和野生型龙须菜CaM与MIPS的表达量进行测定，发现其表达水平均呈现周期性上升趋势，但CaM与MIPS的表达趋势并非完全一致，可见MIPS虽然可能是CaM的一种下游结合蛋白，但其表达水平并未随着CaM的表达水平升高或降低，表明CaM可能不是MIPS唯一的上游激活物质，两种蛋白都具有独立的活性，共同在龙须菜抵御高温胁迫的过程中发挥作用。此外，981龙须菜MIPS的表达水平明显高于野生型，这可能与981龙须菜的耐高温特性直接相关。
龙须菜;热胁迫;钙调素;肌醇-1-磷酸合成酶;转录分析;信号传导途径
中国海洋大学
硕士
遗传学
臧晓南
2012
中文
S917.3
81
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）