半滑舌鳎生殖生理特性及GnRH克隆初步研究
本文以半滑舌鳎为研究对象,运用组织染色法、免疫组织化学技术和放射免疫测定法(RIA),对半滑舌鳎的性腺发育的生理特征、血浆中性类固醇激素、性腺分化的内分泌调节及雄鱼对外源激素诱导的应答等进行了研究,并运用RACE方法克隆出半滑舌鳎脑型cGnRH-Ⅱ基因cDNA全长。相关结果与结论如下:
1.半滑舌鳎卵巢发育的生理学特征研究
采用组织学和形态测量法首次系统研究了人工养殖条件下半滑舌鳎亲鱼卵巢的组织发育的周年变化特征。结果表明:卵母细胞发育可分为6个时相,卵巢发育分为6期。卵巢不同发育时期都由不同类型的卵母细胞组成,半滑舌鳎为非同步分批多次产卵类型。周年发育过程中,6月龄前的鱼卵巢发育处于第1期；9-12月龄卵巢可发育至第Ⅱ期；12月龄半滑舌鳎性腺可发育达到Ⅲ期,并一直保持至24月龄。3龄雌鱼达到性成熟,卵巢可发育至第Ⅳ期；随着水温和光周期的调控,卵巢发育进入成熟期(Ⅴ期),发生水合现象是卵母细胞成熟并准备排卵的信号；产卵结束后卵巢退化至第Ⅵ期,为排出的卵母细胞退化吸收,以Ⅲ期卵巢越冬后,卵巢退化至Ⅱ期并持续至下一个繁殖周期。人工养殖条件下,卵巢内存在卵母细胞闭锁现象,可能是环境胁迫造成的性腺发育不良,同时也是分批产卵特性的一种指示。
在半滑舌鳎性腺的年周期发育过程中,亲鱼各数量特征GSI、HIS、CF都表现出规律性变化。性腺指数(GSI)在性腺达到成熟期(Ⅴ期)其达到峰值,GSI在各月份间值差异显著(p<0.05)。产卵结束后,GSI迅速下降并保持较低的水平至下一个生殖周期。8月后,随着温光调控的进行,GSI显著上升(p<0.05),于10-11月达到峰值。8-11月间GSI值与1-6月间值差异显著(p<0.05),据此可将性腺发育分为8-11月的性腺发育成熟期和12月-7月的休整恢复期。亲鱼肝脏指数(HSI),在产卵前7-8月份达到最大,统计分析表明,7月和8月HSI与其4月-6月HSI值差异显著(p<0.05),表明7-8月份是性腺启动卵子发育、卵黄能量储备的重要时期。肥满度(CF)值在4-6月与其它各月份差异显著(p<0.05),表明这段时间可能是亲鱼调整体内能量分配,进行生殖周期开始前相关营养储备的重要时期,CF值在繁殖盛期10-11月份达到最大。
2.半滑舌鳎血浆性类固醇激素表达与卵巢发育及温光调控的关系研究
采用放射免疫法(RIA)、组织切片技术和形态测量法首次系统研究了人工养殖条件下半滑舌鳎亲鱼卵巢的年周期发育过程中血浆中性类固醇激素[雌二醇(E2)和睾酮(T)]的表达规律与温度和光周期调控的关系。结果表明,性腺的年周期发育过程中,血浆中E2在8月(Ⅳ期)达到峰值,进入产卵期后(9月)开始下降。T含量在9月达到最大值,在10月开始下降。在年周期各月份,雌鱼体内E2表达水平都远高于T表达水平,E2与T呈显著正相关关系。水温调节对E2和T表达水平影响显著且与其呈正相关关系,光周期调节对T和E2表达水平影响不显著。E2表达水平与HSI变化呈显著正相关关系,与CF变化呈负相关关系,T表达水平与HSI变化呈正相关关系,表明性类固醇激素表达水平可用于准确判断鱼类的生殖状态。
3.性类固醇激素及其受体在半滑舌鳎性腺分化发育过程中的表达与生理功能研究
首次用17β-雌二醇(E2)及其受体(ERα)、睾酮受体(AR)的多克隆抗体在半滑舌鳎性腺分化发育过程中进行免疫细胞化学定位研究。结果表明:在半滑舌鳎原始性腺中已有E2、ERα和AR的分布和表达；卵原细胞、初级卵母细胞、精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞对E2及ERα、AR抗体均呈现不同程度的阳性反应,在精细胞和精子中对E2和ERα呈免疫阴性反应,而AR则一直保持较强表达,揭示了半滑舌鳎性腺中类固醇激素可能通过旁分泌调控机制刺激卵子和精子发育和成熟。性类固醇激素及其受体免疫阳性物定位在生殖细胞的胞质、胞膜和核膜等广泛部位并有表达,在性腺分化和不同发育时期的表达强度有所不同,表明其在性腺分化发育过程各阶段所起生理功能不同。
4.外源激素诱导对半滑舌鳎雄鱼增精和精子活力的影响
采用注射外源激素(sGnRH和LHRH)诱导方法,对处于排精末期的半滑舌鳎雄鱼进行诱导调控。结果表明:sGnRH和LHRH都可以诱导处于排精末期的半滑舌鳎雄鱼重新进入排精期,实验鱼总精液量增加,精子活动率和快速活动率显著提高。同时,血浆性类固醇激素(睾酮(T)和雌二醇(E2))表达水平明显升高,以GnRH对雄鱼精液的增精效果为好。
5.半滑舌鳎促性腺激素释放激素(GnRH)基因的分子克隆及表达分析
从半滑舌鳎脑组织提取总RNA,应用RT-PCR方法克隆cGnRH-ⅡcDNA全长,其长度为566bp,包括一个258bp开放阅读框；编码的cGnRH-Ⅱ前体为85个氨基酸残基和一个终止密码子,由一个23个氨基酸组成的信号肽、10个核心cGnRH-Ⅱ氨基酸和3个氨基酸的剪切连接肽(-G-K-R-)和49个氨基酸组成的cGnRH-Ⅱ相关肽。该cDNA编码的cGnRH-Ⅱ的前体氨基酸序列与其他物种的cGnRH-Ⅱ前体一致,表明物种间cGnRH-ⅡcDNA的蛋白编码区高度保守,而非编码区的保守性程度很低。
氨基酸序列和系统进化分析表明:半滑舌鳎cGnRH-Ⅱ氨基酸序列与鲈形目鱼类同源性较高(88％以上),与鲽形目鱼类的氨基酸同源性为85.9％,表明其在鱼类进化过程中的高度保守性。与两栖类cGnRH-Ⅱ同源性较低(56.6％),表明半滑舌鳎cGnRH-Ⅱ基因与两栖类cGnRH-Ⅱ基因在进化过程中出现了分歧或者存在不同的进化速度。采用NJ法系统进化树分析:半滑舌鳎与鲈形目鱼类、鲤形目鱼类和其鲽形目鱼类聚为一个独立的分支。
组织表达分析表明:cGnRH-Ⅱ主要在半滑舌鳎雌鱼的脑和垂体表达,在雄鱼的脑和性腺中表达。sGnRH在雌雄鱼各个组织中均有表达。
半滑舌鳎;卵巢发育;生理特性;性类固醇激素
中国海洋大学
硕士
水生生物
柳学周;潘鲁青
2011
中文
Q959.486
97
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）