斑马鱼p8、p8-L1和p8-L2基因的时空表达及其在胁迫反应中的作用研究
转录因子在动物的生长发育及其对外界胁迫的反应中起着重要的作用。螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子是动物转录因子最大的家族之一。p8,又称com1或Nupr1,是在结构上具有bHLH基序的转录因子。近年来,该基因在哺乳动物应急反应中的作用引起了很大的关注,但其在鱼类胁迫反应中作用还知之甚少。鱼类的生活环境变化较大,在胁迫条件下,易引起自身免疫力的低下,进而导致疾病的爆发。本论文拟以模式鱼类生物-斑马鱼为研究对象,对p8及同样属于p8超家族的p8-L1(p8-like1)和p8-L2(p8-like2)基因进行克隆,阐明这些基因的组织分布及在胚胎发育中的表达规律；在此基础上研究这些基因对各种胁迫因子的响应,并进一步尝试研究它们参与胁迫反应的调控机制,势必会对鱼类的健康养殖具有重要的理论指导意义。
斑马鱼p8 cDNA全长730 bp,位于3号染色体,最大开放阅读框编码一个含有75个氨基酸的蛋白质,理论分子量约8.961KDa,等电点为8.433。斑马鱼p8蛋白在39-65和60-74氨基酸残基处分别有bHLH和NLS的保守序列。斑马鱼p8基因组含有3个外显子和2个内含子,3个外显子大小分别是225bp、138bp和353bp。系统进化树分析显示,斑马鱼p8与脊椎动物的p8亲缘关系较近。p8-L1和p8-L2 cDNA全长分别是742bp和813bp,均位于5号染色体,具有相同的ORF,编码一个含有76个氨基酸的蛋白质,理论分子量均约为8.801KDa,等电点均为8.86。但二者的基因组结构不同,斑马鱼p8-L1基因组含有3个外显子和2个内含子,3个外显子大小分别是291bp、208bp和147bp,而p8-L2基因组只含有1个外显子,大小是813bp。和p8一样,二者均具有Phospho_p8 domain。
Quantitive real-time PCR方法检测三基因的时空表达规律。结果显示,斑马鱼p8mRNA在被检测的各组织和不同的发育时期均广泛表达。其中在脊柱中表达最高,在肝脏、脑组织中表达较强,在鳃、肠、肌肉中表达较弱；斑马鱼p8的mRNA在胚胎发育的各时期差异很大,在卵裂期,母源性的转录物较高存在,随后表达量持续降低,到体节期最低,而在孵化期的表达又急剧升高。这些结果表明,斑马鱼p8是作为一种管家基因在各组织中广泛表达,且可能在胚胎发育中发挥重要作用。斑马鱼p8-L1的组织表达与p8差异较大,而斑马鱼p8-L2与p8较为相近；三者在胚胎各时期的表达模式基本相同,但在孵化期后两者表达升高不明显。另外,胚胎整体原位杂交与Quantitive real-time PCR分析结果基本一致,研究显示,斑马鱼p8基因广泛表达于整个卵裂球中,一直持续到原肠胚期；到了体节形成期,在头部区域和脊索腹面侧区域表达较强,背面侧区域几乎不表达,随着体节的形成逐渐完全,整体表达较弱,头部区域表达较强,躯干及尾部区域信号较弱；到了孵化期,整体表达更弱。斑马鱼p8-L1和p8-L2的表达也均与p8相类似。这些结果提示,斑马鱼p8、p8-L1和p8-L2在中枢神经系统的发育及眼、心脏、血管和内脏等各组织、器官的早期分化中均发挥重要作用。
用多种环境胁迫因子(饥饿、温度、渗透压、pH值)处理成体斑马鱼,Quantitive real-time PCR方法检测斑马鱼p8、p8-L1及p8-L2基因的对不同环境胁迫的响应。结果显示,斑马鱼p8在受到饥饿、温度、渗透压、pH值等不同环境因子胁迫后,其表达都明显上调,证明斑马鱼p8是一个应激相关分子,参与了广泛的胁迫反应。斑马鱼p8-L1及p8-L2基因受到胁迫后(渗透压和pH值),也均有类似的胁迫响应。
最后,通过构建原核表达载体pET-28a／p8,在大肠杆菌中IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱纯化后,获得了预期分子量大小为12.8KDa的纯化蛋白,为进一步在蛋白水平上研究斑马鱼p8的功能和调控机制奠定了基础。
斑马鱼;转录因子;胚胎整体原位杂交;胁迫反应;时空表达;基因克隆
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
刘振辉
2011
中文
Q785;S965.8
125
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）