牙鲆免疫相关基因的克隆与表达分析
实验室前期以我国重要海水经济养殖鱼类牙鲆(Paralichthys olivaceus)为实验材料，利用mRNA差异显示技术(mRNA differential display，DD)获得了一些在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激前后差异表达的基因片段，本研究通过RACE(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术克隆得到了三个差异片段的全长cDNA，利用生物软件对基因的生物信息学进行了预测分析，并借助于半定量RT-PCR技术对基因的时空表达进行了较为详细的研究，并构建了2个新基因的大肠杆菌表达系统，重组基因在大肠杆菌系统中得到了高水平表达，为其进一步研究奠定了基础。现将主要的研究结果分述如下：
1．牙鲆fibrinogenβ基因全长cDNA的克隆及分析
通过DD-PCR和RACE技术，拼接得到了长度为1856bp的牙鲆纤维蛋白原β(fibrinogenβ，EF581895)基因全长cDNA，其中5’UTR为60bp，ORF为1479bp，3’UTR为317bp，可编码492个氨基酸，预测的分子量约为55.72KD，等电点为6.79。它含有一个16个氨基酸组成的信号肽，并含有fibrinogenβ的C末端签名序列(signature)。二级结构分别表明它属于beta型蛋白，空间结构预测显示它与鸡的fibrinogenβ晶体结构模型高度相似。同源性分析表明该基因的氨基酸序列与鱼类以及哺乳动物类的都具有高度的相似性，其中与黄鱼、斑马鱼的相似性分别为81.4％、68.0％，与小鼠和人的相似性分别为55.5％和53.8％。基因时空表达分析表明，fibrinogenβ只在牙鲆对照组的肝脏、肾脏、小肠中表达；注射鳗弧菌后的6小时，在脾脏、心脏和肠中开始表达；注射后的9小时，在鳃中也出现了表达；该基因在各组织中的表达呈现出随注射后时间的延长表达量逐渐增加的趋势，显示其诱导型表达特点。推测该基因在牙鲆鳗弧菌病中一方面起凝血和促进伤口愈合的作用，另一方面可能通过和其他细胞因子的结合在防御细菌的侵染中发挥免疫调节作用。
2．牙鲆免疫相关基因1(P．olivaceus immtme-related gene1，PoIR1)的克隆及分析
通过DD-PCR和RACE技术，拼接得到了长度为997bp的牙鲆免疫相关基因1(EU224373)全长cDNA，其中5’UTR为523bp，ORF为300bp，3’UTR为174bp，可编码99个氨基酸，预测的分子量约为10.46KD，等电点为8.14。基因组DNA序列共含有2个内含子，3个外显子。编码的蛋白含有一个19个氨基酸组成的信号肽，为分泌型蛋白。通过结构功能域的查找，发现此蛋白一个原核生物膜脂蛋白的附着点。经NCBI数据库比对后并没有发现与之相似的序列，因此给此基因命名为牙鲆免疫相关基因1(P． olivaceus immune-related gene1，PoIR1)。半定量RT-PCR结果表明，对照组中，在所有的组织器官(肝脏、肾脏、脾脏、鳃、小肠、心脏、肌肉)中均未检测到PoIR1的表达。鳗弧菌注射后，在所有的组织中均检测到了PoIR1的表达，且随着时间的延长，表达量有明显上升的趋势。推测该基因的编码产物可能是抗菌肽类似的小分子直接参与消灭病原生物或者作为信号分子通过与病原生物的膜结合识别出外界的入侵从而引起机体内部的级联免疫反应。以pET32a为表达质粒，将PoIR1的成熟肽基因序列插入其中构建了pET-32a-PoIR1重组质粒，并在BL21(DE3)pLysS中进行融合表达。SDS-PAGE蛋白电泳和Western Blot分析发现重组质粒在相对分子量29kDa处出现一条特异条带，正好是标签蛋白Trx．Tag相对分子质量(20kDa)与PoIR2的成熟肽相对分子质量(9kDa)的总和，与预期融合蛋白相对分子质量相符，表明成功构建了Trx-PoIR1融合蛋白重组原核表达系统，且大部分以可溶性蛋白形式存在，为进一步从分子水平探讨新基因PoIR1成熟肽的研究奠定了基础。
3．牙鲆免疫相关基因2(P． olivaceus immune-related gene2，PoIR2)的克隆及分析
通过DD-PCR和RACE技术，拼接得到了长度为1061bp的牙鲆免疫相关基因2(EU224372)全长cDNA，其中5’UTR为169bp，ORF为336bp，3’UTR为556bp，可编码111个氨基酸，预测的分子量约为13.84KD，等电点为8.01。基因组DNA序列共含有5个内含子，6个外显子。编码的蛋白含有一个26个氨基酸组成的信号肽，为分泌型蛋白。经NCBI数据库比对后并没有发现与之相似的序列，因此给此基因命名为牙鲆免疫相关基因2(P．olivaceus immune-related gene2，PoIR2)。半定量RT-PCR结果表明，在对照组中，在以下7个组织器官(肝脏、肾脏、脾脏、鳃、小肠、心脏、肌肉)中均未检测到PoIR2的表达。鳗弧菌注射后，在所有的组织中均检测到了PoIR2的表达，且随着时间的延长，表达量有明显上升的趋势。在脑组织中，对照组中有微弱表达，而在注射后表达量上升，3h达到最大，6h后恢复至注射前水平。推测该基因为神经分泌肽，在牙鲆受到鳗弧菌感染后的免疫反应中起到重要的作用。以pET32a为表达质粒，将PoIR2的成熟肽基因序列插入其中构建了pET-32a-PoIR2重组质粒，并在BL21(DE3)pLysS中进行融合表达，SDS-PAGE蛋白电泳和Western Blot分析发现重组质粒在相对分子量31kDa处出现一条特异条带，正好是标签蛋白Trx．Tag相对分子质量(20kDa)与PoIR2的成熟肽相对分子质量(11 kDa)的总和，与预期融合蛋白相对分子质量相符，表明成功构建了Trx-PoIR2融合蛋白重组原核表达系统，且大部分以可溶性蛋白形式存在，为进一步从分子水平对新基因PoIR2的成熟肽研究奠定了基础。
4.16种鲽形目鱼类的系统关系分析
利用fibrinogenβ基因的内含子7(fibint7)、线粒体基因ND6、COII对16种鲽形目鱼类进行了分子系统学分析。木叶鲽的fibint7序列因为小卫星的存在而表现了很高的多态性，而其他15种鱼的均获得单一目的条带，但种间fibint7序列长度跨度很大，分布于81bp-1087bp之间，使得fibint7不适宜用于分析鱼类的系统进化关系。线粒体基因ND6、COIl的扩增中，除半滑舌鳎外的15种鱼均分别得到522bp和691bp的同源序列。根据ND6和COII构建的系统发生树表明，牙鲆科和菱鲆科首先聚在一起，再与鲽科聚为一支；与舌鳎科、鳎科相比，牙鲆科、菱鲆科、鲽科的关联性更大一些。构建的2个系统树中带纹条鳎均首先与木叶鲽聚在一起，与形态分类学观点明显相悖，值得进一步研究。
牙鲆免疫;基因克隆;表达分析;免疫调节作用;伤口愈合
中国海洋大学
博士
海洋生物学
张全启
2009
中文
Q959.4;Q178.53
120
2009-10-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）