噬菌体聚糖酶及其酶解产物的化学及生物学研究初探
细菌胞外多糖是用来研究和制备新型生物寡糖的良好来源，现已发现微生物胞外多糖通常是由双糖至八糖形成的规则的重复单位构成，而这些重复单位则是由2～4种单糖所组成，其中许多糖链上又携带有乙酰、丙酮酸、糖醛酸等特征基团。这些特点决定了胞外多糖组成和结构的多样化。借助于酶解技术，就为批量制备这些重复寡糖序列提供了可能性，从而开发出具有新型生理活性的寡糖因子。本论文以Klebsiella K13为出发菌株，噬菌体聚糖酶为工具酶，期望能获得具有新型生物活性的寡糖组分。
由于胞外多糖产量的大小影响着酶解产物的批量生产。因此本文对影响该菌胞外多糖产量的培养基及培养条件进行了优化，由单因素试验和正交试验确定了该菌株发酵产糖的最佳培养基组成及发酵产糖的最佳条件。以发酵基础培养基为对照，优化条件下对Klebsiella K13进行液体培养，其EPS产量为4.599/L，比对照产量增加了73.9％。
对专一性侵染Klebsiella K13的噬菌体P13的生物学性质进行了初步研究，结果表明该噬菌体形态近似圆形，大小约23nm，核酸类型为单链RNA，核酸长度大于15000bp；该噬菌体的噬菌斑为透明规则的圆形，外围为由于噬菌体聚糖酶释放所形成的半透明环，效价为2.0×109pfu/ml，对宿主细胞的裂解稳定性好，感染宿主菌Klebsiella K13的潜伏期及爆发期较短。
对噬菌体P13所分泌的噬菌体聚糖酶降解胞外多糖的反应条件进行了优化，结果表明反应温度为48℃、胞外多糖浓度为1％、反应液初始pH值为6.5、反应时间为2h及酶液浓度为原液的4倍时该酶降解胞外多糖的活力最高，寡糖的得率约为25％。
在寡糖的生物活性研究方面，采用体外分析方法对获得的酶解产物进行益生元活性和抑菌作用的研究，并选择了其它几种寡糖作比较。结果表明，KlebsiellaK13寡糖(KOS)的PI值较高、产气量低、短链脂肪酸含量一般但种类较多，较适合作为益生元；对寡糖抑菌作用的分析表明，与Oh的细菌数相比，寡糖KOS对大肠杆菌O157的抑制作用及对乳酸菌的促生长作用很明显，对单增李斯特菌的抑制作用不明显，对沙门氏菌的生长有一定的促进作用；对大肠杆菌O157、沙门氏菌的抑菌作用及对乳酸菌的促生长作用，寡糖KOS优于葡萄糖。目前尚没有关于此寡糖相关活性方面的报道，通过该研究丰富了当前寡糖的应用前景。
在寡糖结构分析方面，以酶解产物为研究对象，经分离纯化制备出五、十、十五糖，借助于一级质谱确定了各片段的分子量大小。结合红外光谱，核磁共振图谱及气相色谱等初步确定了寡糖的结构框架。试验表明利用噬菌体聚糖酶降解胞外多糖后得到的酶解产物易于分析、产物组成简单、结果重复性非常高，是我们研究细菌胞外多糖结构的一种理想的工具酶。
噬菌体聚糖酶;生物活性;寡糖结构
中国海洋大学
硕士
食品科学
牟海津
2009
中文
Q814
52
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）