普鲁兰短梗霉HN2-3脂肪酶的生产、分离纯化、基因克隆和表达的研究
从盐场分离到一株高产脂肪酶的酵母菌HN2-3，经酵母常规鉴定方法和分子生物学方法鉴定为普鲁兰短梗霉。该酵母生产脂肪酶最佳培养基组分为3.0％(w/v)橄榄油、0.4％(w/v)葡萄糖、0.6％(w/v)硫酸铵、0.1％(w/v)K2HPO4和0.05％(w/v)MgSO4.7H2O，最佳培养条件为初始pH 7.0、培养温度25℃和转速170rpm。我们发现橄榄油的添加时间对于脂肪酶的生产具有很大的影响，在接种培养6h后加入橄榄油，继续培养96h，脂肪酶产量达到最大，酶活力达到8.0 U/ml。
普鲁兰短梗霉HN2-3胞外脂肪酶通过硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析和阴离子交换层析得到纯化，纯化倍数为3.4。SDS-PAGE显示该脂肪酶分子量约为63.5 kDa。纯化酶的最适作用pH和最适作用温度分别为8.5和35℃，该酶被Hg2+ Fe2+和Zn2+强烈抑制。同时苯甲基磺酰氟可以强烈抑制该脂肪酶的活性。乙二胺四乙酸对该纯化酶的影响不大，碘乙酸可以微弱抑制该酶的活性。纯化的脂肪酶对于花生油具有较强的水解活性。
利用RACE的方法克隆了普鲁兰短梗霉HN2-3胞外脂肪酶的基因。该基因含有一个1245bp的ORF框，同时发现从基因组克隆得到的脂肪酶基因序列中含有一个55bp的内含子。该基因编码一个414个氨基酸残基的蛋白质，在氨基端含有一个26个氨基酸残基的信号肽。推导氨基酸序列含有脂肪酶的保守序列(G-X-S-X-G)和3个推测的N-糖基化位点。通过脂肪酶系统进化树分析，普鲁，兰短梗霉HN2-3脂肪酶与Aspergillus fumigatus(XP_750543)和Neosartorya fischeri(XP 001257768)脂肪酶亲缘关系最近，同源性分别为50％和51％。
将脂肪酶基因克隆到pET-24a(+)表达载体上，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达。SDS-PAGE和免疫印迹分析发现重组蛋白的分子量约为47kDa。测定了阳性克隆BL21(DE3)/pET-24a(+)LIP1细胞裂解液的脂肪酶活力，达到0.96U/mg。重组脂肪酶最适作用pH和最适作用温度分别为8.0和35℃，重组脂肪酶依然对花生油具有较高的水解活性。
普鲁兰短梗霉;脂肪酶;纯化酶
中国海洋大学
博士
海洋生物学
池振明
2008
中文
Q78;Q556
106
2008-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）