东南极格罗夫山土壤微生物多样性及其可培养细菌的产酶和抗菌活性筛选
南极大陆极端的气候条件使其成为地球上最严酷的陆地生境之一。它大部分地区常年被冰雪覆盖,永久无冰区面积仅为其总面积的0.4％左右。无冰区的风化作用及基于稀少有机物的微生物活动导致了南极大部分土壤的形成。东南极内陆地区由于极端低温,年降水量少,曾被认为无土壤形成。位于东南极内陆伊丽莎白公主地(Princess Elizabeth Land)的格罗夫山地区(Grove Mountains;72°20'-73°10'S,73°50'-75°40'E),常年被冰雪、冰原岛峰覆盖。1999–2000年间,中国南极第16次科学考察队在该地区的哈丁山南岭发现三个位点的土壤,是人类首次在东南极内陆高原地区发现土壤,其特殊生境条件可能孕育了独特的微生物类群。本论文通过454焦磷酸测序和对序列数据的生物信息学分析获得了该地区土壤的微生物组成和多样性信息;利用平板法分离获得了土壤中的可培养细菌并对其进行了产胞外酶活性和抗菌活性研究。本研究首次揭示了格罗夫山土壤微生物类群相关信息,为了解南极生态系统的运转和南极菌种资源的利用打下了前期基础。 中国第26次南极科学考察期间,在格罗夫山哈丁山南岭主峰南坡三个相近的土壤位点G1、G2、G3采集表层土壤样品,于-80℃和-20℃各冻存一份。取出-80℃冻存的土壤样品进行宏基因组DNA提取,用带有454接头的特异性引物分别扩增土壤细菌的16S rRNA基因片段和真核微生物18S rRNA基因片段并进行454焦磷酸测序,用多对古菌特异性引物扩增古菌16S rRNA基因片段。对获得的序列数据进行生物信息学分析。结果显示:3个位点的细菌归属于厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌/叶绿体(Cyanobacteria/Cholroplast)、柔膜菌门(Tenericutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、酸杆菌门(Acidobacteria,仅 G1和 G2)、绿弯菌门(Chloroflexi,仅 G1)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus,仅 G3)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes,仅G3)、Candidate division TM7(仅G2)等12大类群,且均以厚壁菌门(Firmicutes)为优势类群,在三个位点所占比例分别为77.00%(G1)、44.56%(G2)和88.76%(G3),变形菌门为格罗夫山土壤的第二大优势细菌类群;通过多种手段均未能扩增得到古菌的16S rRNA基因片段,暗示格罗夫山土壤中的古菌丰度较低或无古菌存在;土壤真核生物归属于真菌(Fungi)、顶复动物(Apicomplexa)、甲藻(Dinophyceae)、黏菌(Mycetozoa)、后生动物(metazoa)、硅藻(Bacillariophyta)、金藻(Chrysophyta)、卵菌(Oomycetes)、绿藻(Chlorophyta)、链形植物(Streptophyta)等10大类群,其中真菌是该地区主要的真核生物(3个位点分别占82.99%(G1)、89.76%(G2)和88.01%(G3)),主要归属于担子菌门(Basidiomycota)和子囊菌门(Ascomycota)两大类群。群落间多样性分析显示:三个位点的土壤中既存在不小比例的共有土壤微生物:三个位点共有的细菌(真核生物)OTU数均大于各土壤位点总细菌(总真核生物)OTU数的19.47%(7.50%),也有一定比例的各自独有的微生物类群;在三个土壤位点中,位点G1和G3的细菌和真核生物群落组成相似度较高,而G2与二者的群落组成相似度略低。本研究通过基于454焦磷酸测序的研究对极端干冷的东南极格罗夫山土壤微生物多样性进行了较为全面综合的评估,洞悉了极端环境压力下的生态复杂性。 稀释直接涂布平板法获得了2种冻存温度下的土壤样品中的可培养细菌菌株,根据菌株的16S rRNA基因序列对其进行系统发生分析。分别用平板法和琼脂块法初步鉴定菌株胞外水解酶产生情况和对5种供试菌的抗性。所有土壤样品共分离得到39株细菌,分别属于厚壁菌门(19株,48.7%)、变形菌门(共计10株,25.6%,分属于α-、β-、γ-变形菌纲)、放线菌门(8株,20.5%)、异常球菌-栖热菌门(1株,2.6%)和拟杆菌门(1株,2.6%)等5个门20个菌属,芽孢杆菌(Bacillus)为优势菌属。-80℃和-20℃冻存的土壤样品分离出的菌株有所不同。上述菌株中,33株具有至少一种胞外水解酶活力,其中具淀粉酶活力的菌株最多(共25株,64.1%),6株细菌可至少抑制一种指示菌的生长。格罗夫山土壤可培养细菌组成在门的分类水平上与南极其他地区土壤一致,但在属的水平上有一定不同;获得的具胞外酶活性和抗菌活性的极地适冷菌株为南极低温酶和抗菌活性物质的进一步开发利用提供了良好的菌种资源。
土壤微生物;物种多样性;抗菌活性;细菌培养;产酶机理
中国海洋大学
硕士
微生物学
张晓华
2014
中文
S154.3;Q939.92
86
2015-04-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）