牙鲆鱼中特征miRNA(miR-206)富集技术的初探
MicroRNAs(miRNAs)是一种广泛存在于生物体内且在进化过程中保守的非编码 RNA,其长度一般为22 nt左右,主要通过沉默复合体降解或者阻遏靶mRNA的翻译,在生物体内发挥重要调节作用,其相关方面的研究已成为科学界增长最快的新热点。特别是近年来对动物通过饮食摄入 miRNA(miR-168a)的研究发现,植物miRNA可以通过饮食调控哺乳动物的生理功能,miRNA作为全新的重要功效因子的地位已经凸显,但仍需大量关于这种跨“界”作用的机理研究。随着miRNA研究的不断深入,对miRNA材料的需求日益增加。目前多使用化学合成的方法制备 miRNA,一般仅适用于微量产品的制备,而且价格极高(每百纳摩尔价格上千元),同时需要使用大量有毒有害化学试剂,已成为制约miRNA研究和应用的瓶颈问题,尤其无法满足miRNA作为摄入功能因子的研究需要,所以急需寻找一种高效、便捷、经济、可食用的 miRNA制备方法。本研究针对牙鲆鱼中特征miRNA(miR-206),依据荧光定量PCR作为检测手段,采用乙醇沉淀法和胶膜电泳法对制备可食用级别miRNA的富集条件进行了探索与优化。 根据茎环引物逆转录定量PCR检测方法,设计两种miRNA茎环引物,对应用该方法检测本研究中涉及miRNA的灵敏度及检测浓度范围进行了研究。结果显示,该方法特异性高,经过38个循环PCR扩增反应未产生非特异性扩增;线性范围广,用miRNA浓度与定量PCR反应Ct值建立的标准曲线可检测10 nM至1 fM浓度的样品,标准曲线的线性相关性良好,R2达到0.99以上。采用该方法对牙鲆鱼骨骼肌及经过初步处理后所得鱼糜水上清中 miR-206定量检测结果显示,样品中均含有丰富的miR-206,是miRNA提取富集的理想材料。鱼糜水超声震荡处理和冻融处理后上清中miRNA含量检测比较显示,震荡组中miR-206浓度为冻融组的近两倍,说明震荡处理较冻融更简便高效,是一种理想的细胞破碎释放miRNA的方式。 利用乙醇的沉淀作用,分别对miRNA水溶液与鱼糜水上清进行了沉淀处理,分析不同乙醇浓度下鱼糜水上清中的miRNA沉淀情况。结果显示,使用乙醇沉淀鱼糜水上清时,乙醇浓度升高后沉淀中miRNA含量明显升高,经过浓度为70％的乙醇处理并低速离心后,鱼糜水中95%以上miRNA富集到沉淀中。依据不同浓度乙醇沉淀结果,选择浓度分别为10%、30%、50%的乙醇依次对鱼糜水上清进行梯度乙醇沉淀,经过逐级分离,最终将miRNA富集与30%乙醇沉淀中,其miRNA占到了总量的近60%,可作为进一步的富集纯化的优良原料。 针对胶膜电泳法分离富集核酸,首先采用一段82 bp的DNA片段对胶膜电泳条件进行了摸索和优化,包括电压(电场强度)、电泳缓冲液浓度(离子强度)、凝胶膜浓度等。经过实验发现,在相同离子浓度(1×TBE)和胶膜浓度(2%)条件下,150 V电压下正极区核酸富集速率是50 V电压时的近8倍,电压越高核酸富集速率越高。缓冲液升温速率与其承受电压成正比,150 V时升温速率为1 oC/min,100 V时为0.5 oC/min,50 V时仅为0.1 oC/min。相同电压(100 V)和胶膜浓度(2%)下使用浓度分别为0.5×、1×、1.5×的TBE作为电泳缓冲液实验发现,离子强度与电泳富集效率有关,0.5×TBE下电泳45 min后正极核酸浓度仅为1.5×TBE时的60%左右。离子浓度高时缓冲液升温明显,1.5×TBE升温速率为0.4 oC/min,1.0×和0.5×TBE升温速率分别为0.2 oC/min和不足0.1 oC/min。凝胶膜浓度实验表明,浓度为1.5%的凝胶通过量最大,是2.5%凝胶的近三倍;浓度为1.5%的凝胶在10 min时即富集出大部分DNA,比另两组时间缩短近10 min。采用优化后的条件电泳富集282 bp DNA溶液45 min后正极富集区DNA浓度由0升高至63 ng/μL,将核酸浓度提高至初始样品的六倍。鱼糜水或经醇沉处理后的鱼糜水沉淀物,继续使用胶膜电泳进行miRNA富集,在0.5 h内,即获得超过9 fmol的miR-206,其中经过乙醇沉淀和蛋白酶处理后的鱼糜水比直接进行胶膜电泳的鱼糜水富集获得的miR-206超出近30倍。
小分子核糖核酸;牙鲆鱼;富集核酸;乙醇沉淀;胶膜电泳
中国海洋大学
硕士
食品工程
董平
2014
中文
TS254.1
86
2015-04-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）