皱纹盘鲍Δ5脂肪酸去饱和酶研究
本论文以皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino）为研究对象，对合成长链多不饱和脂肪酸（Long chain polyunsaturated fatty acid，LC-PUFA）的关键酶-Δ5脂肪酸去饱和酶（Δ5 fatty acyl desaturase，Fad）展开相关研究。研究内容包括：Δ5Fad基因克隆、全长序列分析、基因功能验证和组织表达；同时研究了饲料中不同种类的脂肪酸（C18脂肪酸和 LC-PUFA）以及不同梯度的底物脂肪酸对稚鲍存活、生长、肝胰腺和肌肉组织脂肪酸合成能力以及Δ5Fad基因表达的影响。 1、大多数海水动物 LC-PUFA的合成能力很差，主要是因为缺乏Δ5Fad基因或者Δ5去饱和活性偏低。然而，许多研究表明鲍鱼具有一定的以 C18多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid，PUFA）为底物来合成 LC-PUFA的能力。然而，关于鲍鱼 LC-PUFA合成过程相关酶的研究以及分子调节机制还鲜有报道。本研究成功在皱纹盘鲍体内克隆到了Δ5Fad并对其进行了鉴定分析。研究结果表明，皱纹盘鲍体内存在两条Δ5Fad，Hdhfad1（GQ470626）和Hdhfad2（GQ466197）。Hdhfad1 cDNA全长1530bp，开放阅读框编码一个由438个氨基酸组成的蛋白质，5'端包括99bp的非编码区，3'端包括114bp的非编码区。Hdhfad2全长1525bp，开放阅读框编码一个由439个氨基酸组成的蛋白，5'端包括91bp的非编码区，3'端包括114bp的非编码区。Hdhfad1和Hdhfad2 cDNA序列同源性高达96.82％，编码区氨基酸同源性高达96.58%。它们都具有 front-end去饱和酶的显著结构特征，包括三个组氨酸保守区、细胞色素b5区的HPGG和跨膜结构。进化树分析显示，它们与章鱼Fad的进化关系最近。异源酵母表达分析表明Hdhfad1和Hdhfad2都具有Δ5去饱和功能，对n-3系底物脂肪酸20:4n-3的亲和力大于n-6系底物20:3n-6，并且 Hdhfad1的去饱和活性高于Hdhfad2。Hdhfad1和Hdhfad2在鲍鱼肝胰腺和肠中表达较高，并且在所有检测组织中 Hdhfad2的表达量均高于Hdhfad1。综上所述，鲍鱼体存在两条有功能的Δ5Fad（Hdhfad1和 Hdhfad2），Hdhfad1的去饱和活性高于Hdhfad2，但其组织表达量低于Hdhfad2。本研究为进一步了解鲍鱼 LC-PUFA合成能力提供了分子信息，为将来运用营养手段调节鲍鱼合成 LC-PUFA奠定了分子基础。 2、以体重为0.38±0.01g，壳长为15.06±0.21mm的皱纹盘鲍稚鲍为研究对象，在室内循环水养殖系统中进行为期120天的养殖试验，研究了饲料中的不同脂肪源对鲍鱼存活、生长、脂肪酸组成和Δ5Fad（Hdhfad1和Hdhfad2）基因表达的影响。实验采用6种不同的油脂作为饲料脂肪源配置精制饲料，包括富含16:0的棕榈酸甘油酯（Tripalmitin，TP）、富含18:1n-9的橄榄油（Olive Oil，OO）、富含18:2n-6葡萄籽油（Grape Seed Oil，GO）、富含18:3n-3的亚麻籽油（Linseed Oil，LO）、富含ARA的ARA油（ARA Oil，AO）以及富含EPA和DHA的EPA油（EPA Oil，EO）。每个处理3个重复，每个重复50头鲍鱼。结果表明：各组饲料对鲍鱼的存活率无显著影响，却显著影响了鲍鱼的生长。与对照TP处理组相比，OO（富含18:1n-9）、AO（富含ARA）和EO（富含EPA和DHA）饲料显著提高了鲍鱼的增重率（weight gain rate，WGR）、特定生长率（specific growth rate of weight，SGRW）、贝壳增长率（shell length increase rate，SIR）、贝壳日增长率（daily growth rate of shell length，DGRSL）等生长指标（P<0.05）。GO饲料（富含18:2n-6）组鲍鱼的WGR、SGRW、SIR和DGRSL与对照组无显著差异（P>0.05）。LO饲料（富含18:3n-3）处理组鲍鱼的生长在所有处理组中最差。与对照组相比，OO饲料显著提高了鲍鱼肝胰腺和肌肉组织20:1n-9和22:1n-9的含量。GO饲料显著提高了鲍鱼n-6 PUFA的含量，尤其是ARA。而LO饲料则显著提高了鲍鱼n-3 PUFA的含量，尤其是EPA。AO和EO饲料则显著提高了鲍鱼体LC-PUFA的含量。基因表达分析表明，与对照组（TP）相比，LO饲料中富含的18:3n-3显著提高鲍鱼肝胰腺和肌肉组织Δ5Fads的表达，而饲料中富含的LC-PUFA，比如ARA、EPA和DHA等，显著降低了Δ5Fads的表达。Δ5Fads不受饲料中富含的18:1n-9和18:2n-6的调节。综上所述，鲍鱼具有以C18PUFA为底物合成LC-PUFA的能力，合成关键酶Δ5Fads的表达同时受到底物脂肪酸（18:3n-3）和产物脂肪酸（LC-PUFA）的调节。 3、以体重为0.38±0.01g，壳长为15.06±0.21mm的皱纹盘鲍稚鲍为研究对象，在室内循环水养殖系统中进行为期120天的养殖试验，研究了饲料中的不同梯度植物油（富含18:2n-6的GO和富含18:3n-3的LO）对鲍鱼存活、生长、肝胰腺和肌肉脂肪酸组成以及Δ5Fads（Hdhfad1和Hdhfad2）基因表达的影响。实验制作7种精致饲料，分别含有0%、0.875%、1.5%和3.5%的GO或者LO为脂肪源。饲料脂肪不足3.5%的，添加TP补足到3.5%。TP饲料处理组鲍鱼为对照组。各组饲料分别命名为0%GO/LO（TP）、25%GO、50%GO、100%GO、25%LO、50%LO和100%LO。随着饲料中GO或者LO含量的不断增加，鲍鱼的生长指标（如特定生长率等）显著性的先上升后下降（R2>0.72, P=0.000）。各组鲍鱼的存活率不受饲料中GO（R2=0.04, P=0.815）或LO含量的显著影响（R2=0.50, P=0.046）。脂肪酸分析表明，随着GO饲料中18:2n-6的不断增加，鲍鱼肝胰腺和肌肉组织中18:2n-6、20:2n-6和22:2n-6的含量逐渐增加；肝胰腺中ARA的含量先上升后趋于平稳，而肌肉组织中ARA的含量逐渐增加。随着LO饲料中18:3n-3的不断增加，鲍鱼肝胰腺18:3n-3和20:3n-3的含量不断增加，EPA的含量先上升后趋于平稳，DPA和DHA的含量先上升后下降；肌肉组织中18:3n-3和20:3n-3的含量不断增加，EPA和DPA的含量先上升后保持平稳，DHA的含量则先上升后下降。与对照组相比，50%GO、50%LO和100%LO饲料显著提高了鲍鱼肝胰腺和肌肉组织Δ5Fads的表达量（P<0.05）。其他各组Δ5Fads的表达量与对照组无显著差异（P>0.05）。本研究表明底物脂肪酸18:2n-6和18:3n-3的梯度增加在一定范围内有助于提高鲍鱼Δ5Fads的表达并最终促进LC-PUFA的合成；过量添加会抑制LC-PUFA的合成，并影响鲍鱼生长。
皱纹盘鲍;Δ5脂肪酸去饱和酶;基因表达;合成能力
中国海洋大学
博士
水产养殖
麦康森
2013
中文
S968.315
142
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）