克雷伯氏菌噬菌体P13基因组学及多糖解聚酶性质的研究
噬菌体是一类侵染细菌的病毒，广泛存在于自然环境中，凡是细菌存在的地方都可以发现噬菌体，而目前已分离并研究的噬菌体并不多，截至2013年2月初，EBI数据库中仅收录了1178种噬菌体的基因组序列。噬菌体个体较小，使得其基因组测序和功能基因组学研究都相对容易。进行噬菌体基因组学的研究，对深入探讨生物多样性、基因调控、生长代谢等许多生命现象都具有重大意义。 本文以克雷伯氏菌噬菌体P13为研究对象，对其生物学性质及基因组情况进行了描述。其一步生长曲线显示出，噬菌体P13潜伏期约为20min，爆发期约为40min，属于烈性噬菌体。形态学分析发现其头部直径约为50nm，并具有较短的尾部。采用高通量测序法对其基因组序列进行测定，发现基因组长度为45976bp，为线性双链DNA。 对噬菌体P13基因组的生物信息学进行分析，发现在P13基因组中共具有282个长度大于100bp的ORFs，其中有50个ORFs为假定基因，基因总长度为41329bp，基因平均长度为833bp。在50个假定基因中，有41个基因可找到同源性序列，其中25个基因已确定了功能，13个基因中存在高度保守的序列。通过对每个假定基因及整个基因组序列的同源性比对，发现噬菌体P13与同属于SP6-like属的五种噬菌体相似度极高，结合其形态学特征，确定噬菌体P13属于短尾噬菌体科，Autographivirinae亚科，SP6-like virus属噬菌体。 噬菌体P13基因组中存在着了大量的重复序列，这些序列可能与转录调节、DNA重组及基因组进化有关。在RNA聚合酶基因及主要衣壳蛋白基因上、下游的非编码区皆分别存在启动子及终止子结构，证明这两种蛋白可独立快速表达，是噬菌体整个生命活动中表达量最多也是最重要的两种成分。此外，有多组基因间存在重叠现象，其中基因30(噬菌体头尾连接病毒)与基因31(假定脚手架蛋白)，基因33(尾管蛋白A)与基因34(尾管蛋白)，基因40(末端小亚基蛋白)与基因41(末端大亚基蛋白)之间仅存在1个碱基重叠，这与色氨酸操纵子的结构十分相似，主要功能是使相邻的两个基因能够高效转录表达成对应的蛋白质，且保证产物在数量上相同，以利于协同发挥生物作用。噬菌体P13的C+G含量稍低于宿主菌的，两者密码子偏嗜性也存在很多相同之处，说明噬菌体P13进入克雷伯氏菌体内寄生的历史较久远。 噬菌体P13在侵染其宿主菌克雷伯氏菌K13时能够产生一种热稳定良好的多糖解聚酶，作用是除去宿主表面的多糖，从而使其与细菌细胞壁接触，完成常规的裂解循环。鉴于多糖解聚酶的水解性质，可将其广泛应用于生物膜降解、活性寡糖制备、多糖结构分析及医疗等方面。本文对多糖解聚酶纯化过程中酶活、噬菌体效价的变化进行了研究。从220mL噬菌体P13原液中提取多糖解聚酶，经过丙酮沉淀蛋白、粗酶液透析及超滤离心一系列纯化步骤后，可制备出总酶活为27.5U的纯酶。结合P13基因组中50个假定基因的功能情况，及SP6-like viruses属噬菌体基因组的共同结构特征，推断出基因49及基因50为可能的多糖解聚酶基因。基于分子生物学实验方法，已成功构建了含有目的基因重组质粒的工程菌。
克雷伯氏菌;噬菌体P13基因;多糖解聚酶;生物学性质
中国海洋大学
硕士
食品科学
牟海津
2013
中文
Q939.48
96
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）