鲆鲽鱼Nodal信号途径相关基因的克隆与胚胎发育早期表达分析
Nodal是转化生长因子β(TGFβ)超级家族中的一个成员，Nodal及其下游基因组成的通路在脊椎动物侧板中胚层、内胚层的诱导和胚胎发育期左右模式的构建中发挥了重要的作用。在斑马鱼和小鼠中的研究表明 Nodal信号途径对胚胎发育过程中器官左右不对称的发生起关键作用，此发现对解释鲆鲽鱼变态期间特殊的左右不对称体制构建提供了一条可能的研究途径。其中，lefty作为 Nodal信号通路的下游基因，可以通过与Nodal受体的竞争结合，对其实现反馈调节；而pitx2作为另一个下游基因，受到其激活后出现左右不对称的表达，对心脏、肠道以及身体的正向旋转都有调节作用。另外根据报道，在小鼠中，纤毛驱动的node胞液流动对器官正确位置的建立起着关键作用。纤毛轴丝动力蛋白的重链，有一个环状马达结构域，水解 ATP后，会经历一个构像变化，从而带动动力蛋白以“杆”作为支点运动。其中，dnah9基因编码其中的一条重链。在小鼠模型中，DnaH家族基因编码的轴丝动力蛋白出现在原结纤毛中，显示了其与早期基因的表达和后期器官偏转的关联。本研究通过同源克隆和RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技术获得了舌鳎lefty和pitx2，以及牙鲆dnah9的全长cDNA，利用生物软件对基因进行了生物信息学的预测分析，并借助于实时荧光定量、原位杂交等技术对3种基因不同发育时期的时空表达进行了研究。同时，本文还研究了半滑舌鳎胚胎发育过程中、各组织以及化学处理前后的内参基因的表达变化，筛选出了适合该物种基因表达研究的内参体系。具体结果总结如下： 1.半滑舌鳎内参基因的筛选 不同发育时期，geNorm运算得到GAPDH和B2M最为适用，而BestKeeper得到GAPDH和18S最为适用。对于不同的组织类型，两软件结果相同得出相同的内参基因，最适内参基因为18S和RPL17。对于化学处理，geNorm运算结果为B2M/TUBA，而Bestkeeper结果为UBCE/TUBA。 2.半滑舌鳎lefty和pitx2基因克隆及表达 本文使用同源克隆的方法分别获得了半滑舌鳎lefty和pitx2基因的开放阅读框，其中lefty总长972 bp，推测编码324个氨基酸；pitx2总长939 bp，推测编码313个氨基酸。pitx2编码的蛋白质在Homeobox和OAR两个结构域的区域表现了极强的保守性。lefty与pitx2都存在母源性表达的现象，但是lefty体现为瞬时表达，主要集中在胚胎发育阶段；pitx2除了在胚胎发育阶段表达之外，在成体中也表达，但表达量略有下降。其表达方式与其自身的作用相一致。 3.牙鲆dnah9的cDNA全长的克隆及表达 采用同源克隆与基因组文库相结合的方法，从褐牙鲆中克隆获得了dnah9的cDNA全长序列。cDNA的开放阅读框全长13,611 bp，3'UTR长384 bp，推测编码4573个氨基酸。该基因在基因组 DNA上有两个拷贝，以串联的形式排列。第一个拷贝，总长62,632 bp，共有100个外显子；第二个拷贝总长128,387 bp，共有80个外显子。通过荧光定量分析，dnah9存在母源表达现象，受精之后表达量逐渐降低，囊胚期之后回升，并在15体节期达到峰值。胚胎整体原位杂交也证实了这一现象，并且原位杂交结果还表明在胚胎发育后期dnah9主要集中在胚胎的头部，其中间脑、中后脑和延脑的几个区域。
鲆鲽鱼;Nodal信号途径;基因克隆;胚胎发育;早期表达
中国海洋大学
硕士
微生物学
齐洁;张全启
2013
中文
S965.399
82
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）