基因工程菌株Yarrowia lipolytica 30利用菊芋提取液产柠檬酸的研究
目前柠檬酸的生产主要以富含蔗糖、葡萄糖的原料通过黑曲霉(Aspergillus niger)的深层发酵方式获得，但该菌种容易产生大量的固液废物，并且不利于遗传改造。近些年来，Yarrowia lipolytica已被考虑作为柠檬酸生产的潜在菌种成为研究的热点。从经济角度而言，通过基因工程对Y. lipolytica进行遗传改造对提高柠檬酸产量具有重要意义。本实验室已通过基因手段获得了一株具有菊粉酶活力并敲除ACL1基因且超表达ICL1基因的基因工程菌株Y. lipolytica30，该菌株利用100.0g/l菊粉在发酵罐中一步发酵生产柠檬酸，产酸量可达84.0g/l。为了进一步节约发酵成本，我们考虑以菊芋提取液作为基因工程菌株Y. lipolytica30的柠檬酸发酵底物。 采用单因素实验对菊芋中糖分的提取条件进行优化，得到最佳的处理条件：料液比1:20，提取时间50 min，提取温度100℃，HCl浓度0.05M，提取次数4次。将所得的菊芋提取液经Ca(OH)2处理并进行初步的柠檬酸产量测试，其产酸量为24.3g/l，柠檬酸产率为0.39（g per g TS），而菊芋粗提液产酸量仅为8.21g/l，柠檬酸产率为0.17（g per g TS），说明基因工程菌株Y. lipolytica30利用经过Ca(OH)2处理的菊芋提取液产柠檬酸能力明显提升。 通过摇瓶实验对基因工程菌株Y. lipolytica30利用菊芋提取液进行柠檬酸发酵的产酸条件进行优化。实验结果表明，以菊芋提取液为底物产柠檬酸不需要添加额外的(NH4)2SO4、KH2PO4、VB1和Mg2+，菊芋提取液作为底物的最适总糖浓度为80.0g/l，最适接种量为106cells/50ml。同时我们在10-l发酵罐基础上对基因工程菌株Y. lipolytica30以菊粉底物发酵产柠檬酸条件进行优化，得到最适发酵条件：通气量5 l/min/l，转速300rpm，温度28℃，初始pH6。最后，基因工程菌株Y. lipolytica30在10-l发酵发酵罐中利用菊芋提取液为发酵底物，在上述最适条件下，发酵336 h后，发酵液中的菌体含量达到7.7 g/l，柠檬酸产量最终达到68.3g/l，残余总糖为9.16g/l，还原糖残留量为2.14 g/l，88.5％的总糖被用于合成柠檬酸和细胞生长。 最后利用钙盐法从柠檬酸发酵液中提取得到柠檬酸，经过反复纯化后得到柠檬酸晶体。利用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography HPLC)分析，与柠檬酸标准样品相比提取的柠檬酸样品纯度高达96.0%(w/w)。
基因工程菌株;菊芋提取液;柠檬酸;高效液相色谱
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
池振明
2013
中文
TQ225.41
70
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）