虾夷扇贝IGFBP5、IGF2BP2基因克隆、表达分析及与生长相关的SNP位点筛查

封利颖

中国海洋大学

摘要：

虾夷扇贝（Patinopectenyessoensis）是我国重要的养殖贝类，筛查与其生长相关的基因及基因位点，分析基因表达规律，有助于深入理解其生长性状调控的分子机制，为高产扇贝培育提供参考。本论文首先筛选了适于虾夷扇贝qRT-PCR（Real-time quantitative reverse transcription PCR）分析的内参基因，可用于胚胎/幼虫和高温胁迫前后成体组织中靶基因表达水平分析，进而克隆获得胰岛素样生长因子结合蛋白基因5（insulin-like growth factor binding protein5, IGFBP5）及胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白基因2（insulin-like growth factor2 mRNA binding protein2, IGF2BP2）的全长cDNA和DNA序列，分析了基因的时空表达规律；在两基因中分别获得1个与壳长、壳高、体重、软体重及横纹肌重等生长性状显著相关的SNP（single nucleotide polymorphism）位点。研究结果为解析扇贝胰岛素样生长因子相关基因表达调控机制和功能提供了参考，也为高产虾夷扇贝的选育提供了候选位点。　　1.虾夷扇贝qRT-PCR内参基因筛选　　在GenBank和虾夷扇贝转录组数据库中挑选了12个候选内参基因，分别为β-actin（ACT）、Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）、Cytochrom C（CC）、Nicotinamide adenine dinucleotide（NADH）、elongation factor1-α（EF-1-α）、Ubiquitin（UBQ）、TATA-box bindingprotein（TBP）、60S ribosomalprotein L16（RPL16）、DEAD-box RNAhelicase-like protein（HELI）、β-Tubulin（TUB）、Cyclophilin（CYP）和Histon H3.3（His3.3），利用内参筛选软件geNorm、NormFinder及△Ct法对12个候选内参基因在胚胎/幼虫和高温胁迫前后组织中进行表达稳定性分析。结果表明，虾夷扇贝胚胎/幼虫qRT-PCR分析需要4个内参基因，分别为NADH、CC、His3.3和GAPDH；正常成体组织中共需要3个内参基因，分别为HELI、UBQ和RPL16；在高温胁迫条件下候选内参基因的表达稳定性因组织差异而不同，在检测的6个组织中，最佳内参基因组合分别为：横纹肌：EF-1-α、RPL16和UBQ，性腺：His3.3、UBQ、HELI和CYP，外套膜：HELI、RPL16和UBQ，鳃丝：CC、GAPDH、NADH和TBP，消化腺：HELI和EF-1-α，肾：CC、GAPDH和NADH。常用的内参基因ACT在各条件下表达均不稳定，不是理想的内参基因。　　2.虾夷扇贝IGFBP5（PyIGFBP5）基因克隆、表达分析及与生长性状相关SNP位点的筛查　　获得了虾夷扇贝胰岛素样生长因子结合蛋白相关基因的cDNA全长和DNA序列，经公共数据库Blastp比对发现该基因编码的氨基酸序列与IGFBP5相似性最高。该基因含有3个外显子和2个内含子，编码的氨基酸序列具有信号肽、N端结构域信号及影响与IGFs因子亲和力的PCRCCXXC保守基序、参与其与IGFs因子结合的GICXXV保守基序等，在基因5‘侧翼序列发现了NFIL6、TATA-box、Myb、EBP、CAAT-box、CAAT-box等该基因保守调控元件和肌肉特异性调控元件E-box。qRT-PCR分析显示，PyIGFBP5基因在胚胎发育各时期均有表达，在囊胚期和单轮幼虫期表达量最高，在D形幼虫期表达量最低；在成体虾夷扇贝横纹肌、性腺、外套膜、鳃丝、消化腺和肾中均检测到该基因的表达，且在外套膜中表达量显著高于其它组织（P<0.05），在肾中表达量最低。在基因UTR区共筛查到4个SNP位点C.-117T>C、C.859A>T、C.876C>T和C.1051A>G，其中位点C.1051A>G与壳长、壳高、体重、软体重及横纹肌重显著相关，在两个自然群体中AA型和GG型个体生长性状均显著高于AG基因型个体（P<0.05）。主成分分析结果表明，5个生长性状之间呈正相关。不同基因型的表达分析结果显示，AG型个体的生长性状最低，但在外套膜中PyIGFBP5基因的表达量最高，而生长性状最高的GG型个体中，该基因的表达量最低，暗示该基因参与了扇贝贝壳生长的负调控。　　3.虾夷扇贝 IGF2BP2（PyIGF2BP2）基因克隆、表达分析及与生长性状相关SNP位点的筛查　　获得了PyIGF2BP2基因的cDNA全长和DNA序列。该基因由17个外显子和16个内含子组成，编码591个氨基酸，其中包括2个RNA识别位点和4个K-同源性RNA结合区，与其它IGF2BPs家族成员高度保守。在该基因5‘侧翼序列发现了 GC-box、HSF、Cdx-A、NF-kb、CAAT-box等调控元件，及肌肉特异性调控元件E-box。该基因在胚胎发育过程及成体组织中均有表达。在原肠期和担轮幼虫期的表达量显著高于其它各发育时期，在 D形幼虫期表达量最低；在成体组织中，PyIGF2BP2在性腺组织内表达量最高，肾中最低（P<0.05）。利用重测序手段在编码区获得一个同义突变SNP位点C.852G>A，在两个独立群体中GG型个体的生长性状值显著高于AA型个体（P<0.05）。

关键词：虾夷扇贝;基因IGFBP5;基因IGF2BP2;克隆表达;SNP位点筛查

授予单位：中国海洋大学

授予学位：硕士

学科专业：海洋生物学

导师姓名：包振民

学位年度：2013

语种：中文

分类号：Q959.1;Q785

页数：108

在线出版日期：2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）